阿昔洛韦壳聚糖纳米粒的制备及检验

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[摘要] 目的：筛选出制备阿昔洛韦壳聚糖纳米粒的最佳处方和工艺。方法：采用离子交联法制备阿昔洛韦壳聚糖纳米粒，利用单因素试验、均匀设计试验，筛选出包封率最高的处方及工艺，并考察该条件下制备的纳米粒的形态、粒径分布、表面电位等理化性质。结果：优化筛选出了最佳处方和工艺，并在该条件下制备了阿昔洛韦壳聚糖纳米粒，测得其包封率为87.5%，载药量为17.8%，形态、粒径分布及表面电位等指标均良好。结论：利用离子交联法制备阿昔洛韦壳聚糖纳米粒，方法简便，理化性质良好。

[关键词] 阿昔洛韦；壳聚糖；纳米粒；离子交联法；均匀设计；高效液相色谱法

[中图分类号]R943 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）01（a）-028-02

阿昔洛韦（Acyclovir，简称Acy）是广谱抗病毒药，能选择性抑制病毒DNA聚合酶，阻止病毒DNA合成，适用于单纯疱疹、带状疱疹及免疫缺陷者水痘的治疗。其口服吸收差，仅15%~20%由胃肠道吸收，并广泛分布于各组织与体液中。血消除半衰期（tl/2β）约为2.5 h[1]。据报道[2]，壳聚糖可以附着到黏膜的表面，并能打开上皮细胞的紧密联结，因此，壳聚糖可作为大分子药物的促进剂以提高其生物利用度。为了改善阿昔洛韦口服生物利用度低的缺点，并达到缓释、长效的目的，本实验采用离子交联法[2]将其制备成壳聚糖纳米粒。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪，色谱柱：C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm，Diamonsil公司）；pHS-25数显pH计（海鹏顺科学仪器有限公司）；RCT basic电磁加热搅拌器(德国IKA公司）；TEM-100 CX Ⅱ透射电镜（日本电子公司）；DXD-Ⅱ型电视显微电泳仪（江苏光学仪器厂）。

1.2 试药

阿昔洛韦原料药(常州康丽制药有限公司惠赠，批号20061109）；壳聚糖（自制，平均脱乙酰度84.6%）；三聚磷酸钠（TPP，天津市巴斯夫化工有限公司，批号20060601）；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 壳聚糖纳米粒的制备[3]

将壳聚糖溶于10%的醋酸溶液中，用饱和NaOH溶液调至适宜pH值。将一定量阿昔洛韦加入TPP水溶液中溶解。在磁力搅拌（700 r/min）下，将TPP水溶液以1滴/3 s的速度滴加入上述壳聚糖溶液中，通过阴阳离子的静电作用自发形成纳米粒。将混悬液于4℃下高速离心(12 000 r/min)30 min，收集沉淀物，用纯水洗涤3次，冷冻干燥即得。

2.2 单因素试验

对可能影响包封率的各因素取不同水平，在其他条件相对固定的情况下考察其各自对纳米粒包封率的影响。结果显示，壳聚糖溶液的浓度、壳聚糖溶液的pH值、TPP的浓度和阿昔洛韦的浓度4个因素对包封率影响最大。

2.3 均匀设计试验

依据单因素试验结果，选取上述4个因素采用均匀设计方法[4]选取U6*(64)均匀设计表考查4个因素对包封率的影响。结果见表1。

表1均匀设计试验结果

试验结果经均匀设计V2.1软件处理，逐步回归分析，得回归方程：Y=21.8+13.7X1X4+(5.88e-2)X23 -2.56X32X4，复相关系数R=0.999 4，F=593.2，显著水平P

2.4 验证试验

按处方：壳聚糖浓度3 mg/ml（5 ml），pH值为6，TPP浓度0.4 mg/ml (2 ml)及阿昔洛韦浓度1.4 mg/ml (2 ml)，采用离子交联法制备阿昔洛韦壳聚糖纳米粒。测得其包封率为87.5%，载药量为17.8%。2.5 壳聚糖纳米粒形态观察[5]

取适量壳聚糖纳米粒混悬液滴加于铜网上，用2%磷钨酸钠负染，透射电镜观察其形态。透射电镜照片见图1。由图1可见，本实验制得的纳米粒为类球体。

2.6 粒度分布的测定

光散射测定仪测定纳米粒的粒径，测定结果见图2。由图2可知，壳聚糖纳米粒的粒径集中在100~500 nm。

2.7 表面电位的测定

将阿昔洛韦壳聚糖纳米粒混悬液用蒸馏水配成一定浓度的溶液，用DXD-Ⅱ型电视显微电泳仪测定其表面电位（实验温度20℃，电压29l V）。结果，表面电位为+27.41 mV。

2.8 纳米粒包封率和载药量的测定

2.8.1色谱条件色谱柱：C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水（1090）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：室温；进样量：20 μl。理论塔板数按阿昔洛韦峰计为3 789。在此条件下，阿昔洛韦对照品，载药样品及空白样品的图谱，分别见图3，4，5。

2.8.2 线性试验 按《中国药典》规定，分别配制浓度为5、10、20、30、40、50 μg/ml 的对照品溶液进样测定峰面积，峰面积对浓度进行回归，得回归方程为：A=32 782.0 C+4 066.3，r=0.999 9。

2.8.3 精密度试验分别配制10、30、50 μg/ml 3种浓度的阿昔洛韦标准溶液10 ml，混匀，进样，测定其峰面积，每种浓度测5份。RSD分别为0.57%，0.64% 和0.35%。

2.8.4 稳定性试验分别于0、2、4、6、8 h进样测定，记录峰面积值。计算RSD为0.87%。

2.8.5 重复性试验取同一样品5份，分别制备供试溶液，平行测定，计算RSD为0.54%。

2.8.6 回收率试验 取浓度为10、30、50 μg/ml的样品溶液，分别测定5份。结果见表2。

2.8.7 计算包封率和载药量取阿昔洛韦壳聚糖纳米粒混悬液1 ml，于12 000 r/min (4℃)条件下离心0.5 h。将上清液稀释至一定倍数后取20 μl进样，测定峰面积，用标准曲线方程计算上清液中阿昔洛韦的含量。包封率和载药量按以下公式计算：

包封率EE%=[(x-xf)/x]×100%

载药量LC%=[(x-xf)/xn]×100%

式中x为混悬液中阿昔洛韦的总量，xf为上清液中游离阿昔洛韦的量，xn为纳米粒的总量。

3 讨论

壳聚糖为阳离子聚合物，不溶于普通有机溶剂，在碱液中稳定，有很强的亲水性，可在稀盐酸或稀醋酸中膨胀并形成凝胶，并可结合氢离子而带正电荷。壳聚糖具有良好的生物黏附性、生物相容性及吸收促进作用，在人体内可被多种酶降解，产物安全无毒。它能被机体完全吸收，具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤等作用[2,6]。本试验选用简单易行的离子交联法制备壳聚糖纳米粒。在壳聚糖溶液中加入三聚磷酸盐（TPP)阴离子，利用壳聚糖的游离氨基与TPP阴离子发生分子间或分子内交联反应，从而制备壳聚糖珠球状凝胶。TPP易溶于水，其水溶液呈碱性（1%水溶液的pH值为9.7），因此可先将易溶于碱性溶液的阿昔洛韦溶于其中，再滴加入壳聚糖醋酸溶液中。利用单因素试验和均匀设计试验方法筛选出了包封率高、载药量大、形态、粒径及表面电位适宜的制备阿昔洛韦壳聚糖纳米粒的最佳处方和工艺，并建立了相应的质量控制方法与标准，为阿昔洛韦壳聚糖纳米粒的新药开发研究提供了科学的实验基础。

（致谢：本实验得到山东大学药学院药物制剂研究所的支持和帮助，在此表示感谢！）

[参考文献]

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典2005年版临床用药须知[S].北京:化学工业出版社,2005.

[2]徐连敏.壳聚糖纳米粒的研究进展[J].国外医学药学分册,2002, 29(6):329-332.

[3]何文,匡长春,张洪,等.壳聚糖的分子参数对载药壳聚糖纳米粒体外性质的影响研究[J].中国药学杂志,2005,40(6):438-453.

[4]王元,方开泰.数论方法在统计中的应用[M].北京:科学出版社,1996.

[5]应晓英,胡富强,袁弘.胰岛素壳聚糖纳米粒的制备[J].中国药学杂志,2003,38 (12):936-939.

[6]朱正华,朱良均,陆旋.壳聚糖的制备及其应用[J].科技通报,2003,19(6):521-524.

（收稿日期：2007-10-15）

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