改进的EBSS培养液与常用商品化试剂对鼠胚体外发育的影响
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[摘要] 目的 利用改进后的ebss（SIGMA）培养液和常用商品化培养液G1/G2（Vitrolife），Quinn’s1026/Quinn’s1029（SAGE）对昆明系小白鼠胚胎进行体外培养，以对新建IVF实验室进行评估。 方法 对简单培养液EBSS进行改进，分别制得卵裂培养液和囊胚培养液以构成序贯培养系统。卵裂培养液： EBSS中加入适当浓度的丙酮酸钠，乳酸钠以及5种非必须氨基酸；囊胚培养液： EBSS中加入适当浓度的5种非必须氨基酸及6种必须氨基酸。将胚胎分成4组，A组使用EBSS （Earle’s Balanced Salt Solution）培养液，B组使用改进后的EBSS培养液，C组使用G1和G2培养液，D组使用Quinn’s1026和Quinn’s1029培养液，四种培养液均添加10%人血清白蛋白。结果 72 h后，鼠胚总体囊胚形成率为70.57%（614/870），其中A组的囊胚形成率为26.21%（27/103），B组为72.22%（143/198），C组为73.81%（155/210），D组为80.50%（289/359）B，C，D 3组的囊胚形成率显著高于A组（P
[关键词] EBSS；培养液；鼠胚培养；囊胚；质量控制
[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）05（b）-0007-03
Effects of Improved EBSS Culture Media on the Development of Mouse Embryos in Vitro Compared with Common Commercial Media
RAO Jin-peng1，JIN Min1，JIN Fan2
1.Centre for Reproductive Medicine， The Second Affiliated Hospital， Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou， Zhejiang Province， 310052 China；2.Women's Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang Province， 310006 China
[Abstract] Objective Using improved EBSS（SIGMA） culture media and common commercial media G1/G2（Vitrolife） and Quinn's1026/Quinn's1029（SAGE） to culture mouse embryo of Kunming species in vitro for the assessment of a newly constructed IVF laboratory. Methods Modifying simple culture media EBSS by adding proper concentration of sodium pyruvate， sodium lactate and 5 nonessential amino acids to make cleavage stage media and adding proper concentration of 5 nonessential amino acids and 6 essential amino acids to make blastocyst stage media. 2-cell mouse embryos with normal morphology were collected and divided into 4 groups. Group A was cultured in EBSS （Earle's Balanced Salt Solution）， Group B was cultured in improved EBSS media， group C was cultured in G1/G2， group D was cultured in Quinn's1026/Quinn's1029， and each media was added with 10% human serum albumin （HSA）. Results The general blastocyst formation rate of mouse embryo at 72 h was 70.57%（614/870）. The blastocyst formation rate of group A was 26.21%（27/103）， that of group B was 72.22%（143/198）， that of group C was 73.81%（155/210） and that of group D was 80.50%（289/359）. Compared with group A， the blastocyst formation rate of group B， C and D was significantly higher， respectively （P
[Key words] EBSS； Culture media； Mouse embryo culture； Blastocyst； Quality control
在体外环境中，胚胎自身不具备任何屏障和保护功能，温度，湿度，尘埃，挥发性有机物（VOC），振动，噪音，光照等因素都会削弱胚胎的发育潜能[1]。而在诸多影响因素中，培养液是直接同胚胎接触的最常用也是最重要的消耗品，其性质直接决定着胚胎培养的结局[1-2]。小鼠胚胎生物学检测（mouse embryo assay， EMA）作为实验室质量控制（quality control， QC）的常规方法，在评估IVF实验室培养液质量方面得到了广泛的应用[3]。旨在对新建IVF胚胎实验室进行质量控制，同时探索胚胎培养液的性质，该院生殖中心对简单培养液EBSS进行了一定的改进，并在2014年9月―2015年1月期间，将其应用于鼠胚的体外培养，并与改进前的EBSS和另外两种商品化序贯培养液在4细胞胚胎，8细胞胚胎，融合胚以及囊胚形成率上进行了对比分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 实验动物 7周龄雌性昆明系小白鼠（体质量30～35 g），10周龄雄性小鼠（体质量35～40 g），均购自浙江中医药大学实验动物中心，雌雄分笼饲养。
1.1.2 药物与试剂尿 促性素（HCG）与绒促性素（HMG）均购自丽珠制药厂。简单培养液EBSS以及丙酮酸钠，乳酸钠及11种氨基酸均购自SIGMA公司，序贯培养液G1和G2以及配子处理液G-GAMETE购自Vitrolife公司，序贯培养液Quinn’s1026和Quinn’s1029，人血清白蛋白（HSA）以及石蜡油均购自SAGE公司。培养液均添加10%HSA，表面覆油后置于37 ℃，6.0%培养箱中平衡过夜。
1.2 实验方法
1.2.1 改进的EBSS培养液的配制 卵裂培养液：向EBSS中加入丙酮酸钠并使其浓度达到0.4 mmol/L，加入乳酸钠并使其浓度达到7 mmol/L，以及丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸等5种非必需氨基酸并使其浓度均达到0.1 mmol/L；囊胚培养液：调节乳酸钠浓度至5 mmol/L，加入丙氨酸，天冬酰胺酸，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸等5种非必需氨基酸并使其浓度均达到0.1 mmol/L（同卵裂培养液），加入精氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，缬氨酸等6种必须氨基酸并使其浓度达到0.25 mmol/L。
1.2.2 鼠胚获取与培养 雌鼠腹腔注射10 IU的HMG，48 h后再注射HCG，注射后立即将雌雄按1：1的比例合笼，48 h后取胚。将孕鼠颈椎脱臼处死后用眼科剪取输卵管放于覆油的G-GAMETE配子处理液中，用1 mL注射器针头将输卵管切割数次，挤出胚胎，再用拉细的巴斯德管将2细胞鼠胚收集并随机分装到覆油的4种不同培养液中，并置于培养箱中培养。当胚胎培养到8细胞阶段，A组将胚胎转移到新配制并于前1 d过夜平衡后的EBSS培养液，B，C，D 3组分别将胚胎从卵裂培养液转移到经过夜平衡的囊胚培养液中继续培养。
1.2.3 鼠胚的观察 观察并记录24 h后4细胞胚胎形成率，48 h后8细胞或融合胚形成率，72 h后囊胚形成率。
1.3 统计方法
用SPSS 19.0分析软件对所得计数数据进行χ2检验。
2 结果
在2014年9月―2015年1月期间，该院新建IVF胚胎实验室共进行11个周期的鼠胚体外培养实验，累计获取2细胞胚胎870枚，其中形成囊胚共614枚，总体囊胚形成率为70.57%。鼠胚培养分成4个组别进行，B，C，D 3组的囊胚形成率显著高于A组，差异有统计学意义（P
表1 鼠胚在4个组别不同培养液中不同阶段的发育情况
图1 2-细胞鼠胚于覆油35 mm皿中体外培养不同时期的生长情况图
A：2-细胞鼠胚；B：4-5细胞鼠胚；C：8细胞及融合鼠胚；D：扩张囊胚
图A为处死小鼠当日从雌鼠输卵管中取出的2细胞胚胎；图B为使用改进后的EBSS培养液进行培养，24 h后发育形成的4-5细胞鼠胚；图3为48 h后形成的8细胞鼠胚及早期融合鼠胚；图4则为72 h后形成的鼠胚囊胚。
3 讨论
严格的实验室质量控制与质量保障系统为胚胎的生长发育提供相对稳定的场所，建立稳定可靠的IVF实验室对于最大限度地维持胚胎发育潜能，维持IVF成功率具有重要的作用[1]。在体内，胚胎的外环境是输卵管液和子宫分泌液，而在体外，胚胎的环境即是与其直接接触的培养液。可以说，培养液的组分种类，组分含量和含量比，pH，渗透压等直接决定了胚胎培养的结局[4]。为了检测新建IVF胚胎培养室是否达到人类胚胎培养标准，同时探索是否存在一种更加经济的培养液同样能达到与常用商品化试剂相同或相近的胚胎培养效果，该院生殖中心对EBSS进行了改进，并与其他两种商品化培养液一起对昆明系小鼠胚胎进行体外囊胚培养实验。
通过对比简单培养液EBSS与两种商品化序贯培养液的组成成分[1，5]，该研究发现简单培养液EBSS在无机盐离子组分与浓度上与商品化培养液G1/G2，Quinn’s1026/Quinn’s1029大致相同，说明3种培养液都能对细胞内的离子水平进行调节，以维持胚胎外环境渗透压的稳定。但在胚胎发育所必需的能量物质方面，简单培养液EBSS仅含有葡萄糖及低浓度的丙酮酸钠。由于处于早期分裂阶段的胚胎代谢活动相对较弱，细胞的氧化及生物合成水平较低，故不能很好地利用葡萄糖，而只能利用丙酮酸和乳酸作为能量来源[6]，这也导致了仅以EBSS作为培养液的大部分小鼠胚胎发育均阻止在2细胞阶段（103枚2细胞中有71枚发育停滞，卵裂率仅为31.07%）。而简单培养液EBSS的另外一个不足之处是其不含氨基酸等复合成分。尽管有证据表明，人胚胎可以在缺少氨基酸的培养环境中生长[7]，但氨基酸具有作为蛋白质类物质生物合成前体，能量来源，参与调节胚胎能量代谢，调节渗透压，调节pH，抗氧化，信息传递，调节胚胎分化和参与胚胎细胞基因表达等多种生物学功能[8-10]。而相关研究表明，在8细胞期前，输卵管中非必需氨基酸浓度最高，胚胎也主要消耗此类氨基酸，而在8细胞期后必须氨基酸则能刺激内细胞团的发育[11]，故胚胎在此阶段则同时利用非必需氨基酸和必须氨基酸。考虑到早期胚胎能量物质及氨基酸在胚胎发育中的重要作用，再参照G1/G2和Quinn’s1026/Quinn’s1029的组分情况，我们对EBSS进行了必要的改进（参见实验方法1.2.1）。
鼠胚体外发育的结果显示，改进的EBSS克服了2细胞阻滞，在所获得的198枚2细胞中，有177枚发育到4-5细胞阶段，卵裂率为89.39%远高于未经改进的EBSS 31.07%，而在加入乳酸钠和11种氨基酸改进成囊胚培养液后，其囊胚形成率72.22%也远高于改进前的 26.21%，这一结果与美国梅奥医学中心的Morbeck等最近在Fertility and Sterility的研究报告显示的用SAGE系列序贯培养液的鼠胚囊胚形成率75%，以及用Vitrolife系列序贯培养液的培养结果78%相近[5]，而由于通过改进后的EBSS在成本上较之其他商品化培养液有大幅度的降低，说明其更经济，在鼠胚体外培养上具有更好的实用价值。
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（收稿日期：2015-02-06）