多参数流式细胞术观察CD36在白血病细胞上的表达及其意义

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【摘要】 本研究旨在探讨cd36在白血病细胞的表达及其在白血病诊断和鉴别诊断中的意义。采用cd45/ssc 参数设门多色流式细胞术分析133 例白血病细胞cd36 及其它白血病相关抗原的表达情况。结果表明： 133 例白血病中有29例患者(21.8%)的白血病细胞表达cd36,62例急性髓系白血病(aml)中26例患者(41.9%)白血病细胞表达cd36, 54例淋系白血病未见cd36阳性的病例。m4、m5和m6中cd36的阳性率（8/10、12/12、3/3）明显高于m1（0/9）、m2（3/12）、m3（0/16），具有统计学差异（p值均<0.001）；cd36在m5b组的阳性细胞百分数（中位数89.6%）明显高于m5a组（中位数32.7%）（p=0.001）。在急性髓系白血病中， cd36的表达与cd117呈负相关(r=-0.751, p=0.005)，与hla?dr、cd34不相关； 在m4和m5b组中cd36与cd14的表达呈正相关（r=0.870, p=0.011）；在单核细胞相关性白血病(mlil)中cd36阳性率为92.6%（25/27），cd14的阳性率为48.1%（13/27），前者明显高于后者（p=0.001），在m5a中cd14未表达，在m5b中cd14表达为100%(5/5)； cd117在m5a的阳性率明显高于m5b（p=0.010）；cd34在m5的阳性率较低（33.3%，4/12）。结论： 结合cd36与其它淋系及髓系抗原有助于淋巴系白血病、髓系白血病及其单核细胞相关性白血病的诊断与鉴别, 其在单核细胞相关性白血病阳性率为92.6%（25/27），高于cd14（41.8%，13/27）。

【关键词】 cd36 免疫表型 多参数流式细胞术

cd36 expression in leukemia cells checked with multi?parameter flow cytometry and its significance

tang hua?rong, wang fa?chun, jiang yun?wei, fei xia, jiang qian1, xu wen?lin,

lin jiang

central laboratory, people hospital, jiangsu university, zhenjiang 212002, china; 1department of medical laboratory examination, jiangbing hospital, jiangsu university, zhenjiang 212002, china

abstract the aim of study was to investigate the expression of cd36 in leukemia cells and to explore its significance in diagnosis and differntial diagnosis for leukemia in patients. blood samples from 133 cases of leukemias were analyzed by cd45/ssc double parameters and multi?color flow cytometry in order to determine the cd36 and other leukocyte differentiation antigens. the results show that the cd36 positive rate was 21.8% (29/133) in 133 cases of leukemia, 41.9% (26/62) in 62 cases of aml(acute myeloid leukemia), and none of the 54 cases of lymphocytic leukemia was positive for this antigen. the positive rate of cd36 in m4(8/10), m5(12/12) and m6(3/3) was significantly higher than that in m1(0/9), m2(3/12), m3(0/16) (all p<0.001). the percent of positive cells of cd36 in m5a was significantly higher than in m5b(p=0.001). a significantly negative regression was found between cd36 and cd117 in aml(r=-0.751, p=0.005). and a significantly positive regression was found between cd36 and cd14 in m4 and m5b (r=0.870, p= 0.011). in monocyte lineage involved leukemia (mlil), the positive rate of cd36( 92.6%, 25/27 ) was significantly higher than that of cd14 ( 48.1%, 13/27)（p=0.001）. none of the 7 cases with m5a was positive for cd14, but 4 of 5 cases of m5b were positive. the positive rate of cd117 in m5a was significantly higher than that of in m5b（p=0.01）. the positive rate of cd34 in m5 was low (33.3%,4/12). it is concluded that the combination of cd36 with lymphoid and myeloid antigens is helpful to the diagnosis and differential diagnosis of lymphoid, myeloid and mlil. the positive rate of cd36 is higher than that of cd14 in mlil.

key words leukemia; cd36 antigen; immunophenotyping; multi?parameter flow cytometry

j exp hematol 2007; 15(1):29-34

近年来的研究表明,流式细胞术( fcm) 检测结果对于确定白血病的诊断与分型至关重要。以往采用横向分析的方法对白血病进行免疫分型的报道较多,而对于某一个特定标志在白血病免疫学诊断中的作用报道较少。

单核细胞相关性白血病(monocyte lineage involved leukemia, mlil)包括急性粒细胞单核细胞白血病(aml?m4a、m4b、m4c、m4eo)、急性单核细胞白血病未分化型（aml?m5a）、急性单核细胞白血病部分分化型（aml?m5b）、以幼稚单核细胞增生作为白细胞成分的急性红白血病（aml?m6）、慢性髓细胞白血病急性单核细胞变（cml?mobc）、慢性粒细胞单核细胞白血病（cmml）等均存在单核细胞成分。目前国际上普遍采用cd14作为单核细胞的表面标志而应用于白血病的免疫学诊断，但cd14 的阳性表达率较低，这给白血病（尤中国实验血液学杂志 j exp hematol 2007; 15(1)多参数流式细胞术观察cd36在白血病细胞上的表达及其意义其是单核细胞相关性白血病）的免疫学诊断与鉴别带来了一定的困难［1］。

cd36为一种膜糖蛋白，在造血细胞上主要表达于单核细胞、巨核细胞、红系前体细胞［2］。我们采用多种高质量标准单克隆抗体和cd45/ssc设门多参数fcm对133例各类白血病患者白血病细胞中cd36的表达情况作了深入的分析,重点分析其在单核细胞相关性白血病上的表达情况，并分析了它与其它白血病细胞相关抗原如cd117、hla?dr、cd34等的相互关系, 结果报道如下。

材料和方法

对象

2003 年10月-2005 年12 月来本院就诊以及外院送本院作细胞表面标记检查的白血病患者共133例,其中男性71例,女性62例,均为初诊病例。患者年龄1.5岁-86岁,中位年龄44岁。急性白血病95例, 按fab 标准［3］诊断为急性淋巴细胞白血病(all)32例;急性髓细胞白血病(aml )62例,其中m1 9例,m2 12例,m3 16 例,m4 10例,m5a 7例, m5b 5例,m6 3例；参照1994 年欧洲白血病免疫分型研究组( egil)关于急性混合细胞白血病(acute mixed lineage leukemia, amll) 诊断积分标准［4］, 诊断为amll 1例。慢性白血病38例, 其中慢性淋巴细胞白血病(cll) 22例,慢性髓细胞白血病(cml) 15例,慢性期13例及单核细胞白血病急性变2例，慢性粒细胞单核细胞白血病（cmml）1例。

样本制备

每管加入肝素抗凝的骨髓100 μl（细胞数1×105-1×106）及3种直接标记的荧光抗体各5-10 μl, 20℃反应20分钟,再加入2 ml细胞溶解液(becton dickinson产品) ,振荡后于室温下置10 分钟,用pbs?bsa 洗涤细胞1 次,加入0.5 ml pbs，待测 。

试剂

所用标准单克隆抗体包括fitc、pe、percp 标记的cd10、cd19、cd20、cd22、cd2、cd3、cd5、cd7、cd56、cd11b、cd41a 、cd61、cd117、cd38、cd45、hla ? dr、mpo（髓过氧化物酶） 单克隆抗体均购自美国becton dickinson 公司，cd13、cd14、cd33、cd34、cd36单克隆抗体购自美国coulter公司。

流式细胞术分析

fcm 检测用facscaliburtm流式细胞仪(becton dickinson产品) 和cell quest 软件获取并分析10 000个细胞。通过cd45/ssc 设门识别幼稚细胞群, 再分析计算该幼稚细胞群各白血病相关抗原的阳性百分数。以白血病细胞表面抗原阳性百分数≥20%为抗原阳性病例。

统计学处理

用spss 10.0软件包进行统计学处理,作相关分析、χ2 检验或fisher确切概率法，以p<0.05表示有显著差异。

结 果

cd36在白血病细胞中的表达

图1为一正常骨髓cd45/ ssc散点图。根据各群细胞cd45荧光强度与侧向角反射（ssc）的差异可将骨髓细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、

figure 1. dot plot of cd45-side scatter (ssc) of normal bm cells. r1 is blast cells ; r2 is nucleated erythrocytes; r3 is granulocytes; r4 is monocytes; r5 was lymphocytes.

有核红细胞和原始细胞群，对不同的细胞群体框定（即射门）后，即可知各群细胞所占的比例，并可明确显示幼稚细胞群体的免疫表型（图2）。

figure 2. dot plot of cd45-side scatter (ssc) of leukemia bm cells. r1 is blast cells ; r2 is nucleated erythrocytes; r3 is granulocytes; r4 is lymphocytes.

133例病人中cd36阳性29例（阳性率21.8%），62例aml患者中表达cd36者26例，阳性率为41.9%。但54例淋系白血病中（其中all 32例， cll 22例）未见cd36阳性病例。15例cml中慢性期13例未见cd36阳性表达，另外2例cml单核细胞白血病急性变的患者cd36阳性，1例患者的免疫表型为： cd34+、cd38+，cd10+，cd13+、hla?dr+、cd36+、cmpo+/-；另1例患者的免疫表型： cd38+，hla?dr+，cd14+， cd36+、cd13+，cd33+，cd11b+。1例amll患者cd36表达为阴性。1例慢性粒细胞单核细胞白血病（cmml）cd36表达阳性，该患者表型为：cd13+、cd33+、cd14+、cd10+、hla?dr+、cd36+、cd11b+（表1）。

在aml 各亚型中的表达

在62例aml中cd36在m1 、m2 、m3、m4、m5a 、m5b 、m6中阳性率分别为0.0% (0/ 9) 、25.0% (3/ 12) 、0.0% (0/ 16) 、80%(8/10) 、100.0 %(7/ 7) 、100.0%(5/5) 、100.0%(3/3)。可见cd36阳性表达主要见于m4、m5、m6, 其阳性率明显高于m1、m2、m3，差异具有显著性（χ2=25.593, p<0.001； χ2=17.422, p<0.001； χ2=33.529, p<0.001）。在m4中，2例m4eo的患者全部为阴性，阳性细胞百分率分别为7.1%和8.6%。余8例m4a/b/c均为阳性，阳性细胞百分率20.5%-89.2%，中位数为28.4%。9例m5患者中cd36表达均为阳性，阳性细胞百分数25.3%-95.2%，中位数为50.8%。但在m5b组的阳性细胞百分数（50.8%-95.2%，中位数为89.6%）明显高于m5a组（25.3%-36.5%，中位数为32.7%），差异具有统计学意义（f=15.273,p=0.001）。3例m6中2例为急性红白血病，1例为急性红血病。在2例急性红白血病的骨髓细胞群体中有两个异常细胞群体，一个群体为幼稚红系群体，另一个群体为幼稚粒细胞单核细胞群体。在幼稚粒单核细胞群体中2例均为cd36阳性表达，阳性细胞百分数为40.0%和73.4%。1例急性红血病的骨髓细胞中只有1个异常群体即幼稚红细胞群体。在3例患者的幼稚红细胞系群体中的cd36阳性细胞百分数33.60%-77.8%，中位数为73.2%。 这例急性红血病患者的免疫表型为：cd33+、hla?dr+、cd36+、cd235a+、cd117+、cd71+、cd38+。在m1、m2、m3中只有3例m2a患者cd36表达阳性，其阳性细胞数百分数分别为22.1%-27.4%，中位数为24.3%（表2）。

在aml组中，cd36表达的阳性细胞百分数与cd117表达的阳性细胞百分数呈负相关(r=-0.751, p=0.005)。在12例m2中2例为cd36+cd117+,1例cd36+cd117-， 8例cd36?cd117+，1例cd36-cd117-; m4组7例cd36+cd117+，1例cd36+cd117-，2例cd36-cd117+。7例m5a全为cd36+cd117+，5例m5b中1例为cd36+cd117+，4例为cd36+cd117-。在m6 3例患者中全为cd36+cd117+（图3）。在aml组中，cd36的阳性表达与hla?dr的阳性表达不相关（r=0.142, p=0.677）.在12例m2中3例cd36+hla?dr+，4例cd36-hla?dr+，5例cd36-hla?dr-。10例m4中6例cd36+hla?dr+，2例cd36+hla?dr-，1例cd36-hla?dr+，1例cd36-hla?dr- 。在7例m5a组中4例cd36+ hla?dr+, 3例cd36+hla?dr-。在5例m5b组中4例cd36+hla?dr+，1例cd36+hla?dr-。在m6均为3例患者均为cd36+hla?dr+。另外，在aml组中cd36的阳性表达与cd34的阳性表达不相关（r=-0.472, p=0.076）。在12例m2中3例cd36+cd34+，0例cd36+cd34-，6例cd36-cd34+，3例cd36-cd34-。10例m4中5例cd36+cd34+，3例cd36+cd34-，1例cd36-cd34+，1例cd36-cd34- 。在7例m5a组中3例cd36+ cd34+, 4例cd36+cd34-。在5例m5b组中1例cd36+cd34+，4例cd36+cd34-。在m6中1例为cd36+cd34+，2例为cd36+cd34-。在m4与m5b组别中cd36与cd14表达的阳性细胞百分数呈正相关(r=0.870, p=0.011)。在12例m2中3例cd36+cd14-，9例cd36-cd14-；

cd36阳性白血病其它髓系主要相关抗原的表达

cd14在cmml、cml?mobc、m2、 m4、m5a、m5b、m6中阳性表达率分别为100.0%（1/1）、50.0%（1/2）、0.0%（0/12）、60.0%（6/10）、0.0%（0/7）、100.0%（5/5）、0.0%（0/3）。cd117在cmml、cml?mobc、m2、 m4、m5a、m5b、m6中阳性率分别为0.0%（0/1）、0.0%（0/2）、83.3（10/12）、90.0%(9/10)、100.0%(7/7)、20.0%(1/5)、100.0%（3/3）。cd117在m5a中阳性率明显高于m5b（χ2=8.400, p=0.010）。cd34在其分别在cmml、cml?mobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达率为0.0%（0/1）、50.0%（1/2）、75% (9/12)、60.0%(6/10)、42.9%(3/7)、20.0%(1/5)、33.3%（1/3）。cd34在m5的阳性率较低，为33.3%（4/12）。hla?dr分别在cmml、cml?mobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达分别为100%（1/1）、100%（2/2）、66.7% (8/12)、70.0%(7/10)、57.1%(4/7)、80.0%(4/5)、100%（3/3）。cd13分别在cmml、cml?mobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达率分别为100%（1/1）、100.0%（2/2）、100%(12/12)、90.0%(9/10)、85.70%(6/7)、60.0%(3/5)、66.7%（2/3）。cd33分别在cmml、cml?mobc、m2、m4、m5a、m5b、m6的阳性表达率分别为100%（1/1）、50.0%（1/2）、91.7%(11/12)、80.0%(8/10)、58.7%(6/7)、100.0%(5/5)、66.7%（2/3）（表3）。

讨 论

cd45 抗原表达于所有白细胞表面,虽然cd45 抗原存在3 个异构体,不同异构体在造血干/ 祖细胞及t 细胞表面表达不同,但本研究所用的cd45 抗体为识别3种异构体的共同抗体。cd45 在淋巴细胞、单核细胞、粒细胞及幼稚细胞的表达量不同,表现为cd45荧光强度不同。淋巴细胞最强,单核细胞次之,粒细胞比单核细胞弱,幼稚细胞比成熟细胞弱。结合细胞的ssc 值(反映细胞的颗粒性) ,可将骨髓细胞分为淋巴细胞,单核细胞,粒细胞及幼稚细胞群。cd45/ ssc 设门法的突出特点在于它可将异常的幼稚细胞与正常的成熟细胞区分开,因而能够做到特异地对幼稚细胞进行分析［5］。我们在采用cd45/ssc双参数射门的基础上应用一系列高质量标准单克隆抗体对较大样本白血病细胞cd36 的表达作了较为详细的分析。结果发现，在133例白血病患者中aml组有41.9%（26/62）的患者cd36表达阳性，在54例淋巴细胞白血病中无1例cd36阳性表达。cd36是一种细胞膜糖蛋白，在造血细胞中它主要表达于单核细胞、红细胞前体、血小板、巨核细胞上。本研究中12例伴有单核细胞分化的aml?m4和aml?m5亚型的病人中cd36表达全部为阳性，cml单核细胞白血病急性变2例及cmml 1例为cd36阳性，12例aml?m2亚型组有3例cd36表达阳性。另外2例以单核细胞增生的aml?m6 cd36表达全部阳性。作为单核细胞分化的抗原之一，其敏感性为92.6%（25/27）。虽然cd14 是单核细胞的特异性标志,但cd14 只有在成熟的单核细胞表达为阳性,幼稚单核细胞cd14表达为阴性。而多数m4/ m5 患者为幼稚单核细胞增多。因此免疫分型难以根据单项cd14 是否阳性而诊断m4/ m5。在本研究中cd14在单核细胞相关性白血病上的阳性率仅为48.1%（13/27），低于cd36的阳性率（92.6%，25/27）。cd14在m5a上阳性率为0.0%(0/7)，在m5b中阳性率为100%（5/5）。因此，在诊断单核细胞相关性白血病中结合cd36与其它单核细胞分化抗原(如cd14、cd64等)分析，有利于提高其诊断率。在aml?m2组中有3例患者的cd36表达阳性，其原因可能与白血病细胞群体中混有部分单核细胞成分有关。cd36除了表达在单核细胞外，还在巨核细胞和早期红细胞上有表达。在本研究中3例m6患者，在幼稚红系群体上都有cd36的高表达，但他们同时都有glya和cd71的表达。因此同时加做cd41和（或）cd61（巨核系标志）、glya和/或cd71（红系标志）及单核系其它标志抗原，可以将巨核细胞、早期红细胞及单核细胞区分开来。这也同时说明，在白血病的诊断分型中须综合多参数信息来分析。

在单核细胞上cd36随细胞的分化成熟而表达增加。在m4与m5b组中cd36与cd14的表达呈正相关。急性单核细胞白血病m5b的白血病细胞与m5a相比，前者在分化程度上较后者要成熟些，尽管本研究结果中显示cd36在m5中都为阳性表达，但其在m5b上的表达的阳性细胞百分数明显高于m5a，因此将cd36和cd14结合分析有助于m5的诊断及分型。m4为粒细胞和单核细胞成份同时存在，m4eo除了具有前面的特征外，嗜酸性粒细胞比例增多大于5%-30%。在本研究结果中显示2例m4eo均为cd36表达阴性，他们的cd14表达也为阴性。其余的6例m4患者cd36表达均为阳性。cd36是否有助区分m4的亚型还需要更多的病例数来分析。cd14在m4患者中阳性率为60.0%（6/10），这与冯国安等［6］和宁铂涛等［7］报道的较为相似。在aml组中cd36的表达与cd117呈负相关，m5a中cd117阳性率为100%（7/7），阳性细胞百分数为28.6%-92.5%，中位数为53.9%；cd36的阳性为100%（7/7），但其阳性细胞百分数为21.3%-36.5%，中位数为32.7%；m5b中cd117阳性率为20%（1/5），阳性细胞百分数为21.0%，而cd36的阳性率为100%，阳性细胞数为50.8%-95.2%，中位数为89.6%。cascavilla等［8］检测了9例m5a患者，其白血病细胞都表达cd117，而在11例m5b中仅有1例表达该抗原。由此可见cd117主要在较幼稚的单核细胞上高表达，而cd36随着单核细胞的成熟而表达增高。因此，结合cd117的表达情况也有助于区分亚型并可了解单核细胞的分化程度。另外，在aml组中cd36与hla?dr、cd34的阳性表达不相关。cd34在m5患者中多数（66.7%，8/12）为阴性表达，这与weir［9］和刘艳荣等［10］报道相似。

综上所述，本组资料说明：cd36阳性者可以排除淋系白血病（amll除外）；cd36作为单核细胞系分化的指标之一，其敏感性（92.6%，25/27）高于cd14（48.1%，13/27），但cd36还表达于红系前体细胞、巨核细胞上，因此须结合cd36与其它单核细胞分化抗原分析才有助于提高单核相关性白血病的诊断率；另外cd36结合cd14和（或）cd117有助于区分m5亚型及了解单核细胞分化程度。

【参考文献】

1khalidi hs, medeiros lj, cheng kl, et al. the immunophenotype ofacute myeloid leukemia: high frequency of lymphoid antigen expression and comparison of immunophenotype, french?american?british classification, and karyotypic abnormalities. am j clin pathol, 1998; 109 : 211-220

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5li w, chen z, liu z, et al. application of cd45/ssc gating multiparameter flow cytometry in the classification of acute leukemia —— an analysis of 139 cases. j tongji med univ, 2001; 21:209-211

6冯国安，郭农建，黄平等. 单核细胞相关性白血病fcm免疫表型分析. 白血病·淋巴瘤， 2005；14：148-150

7宁铂涛, 汤永民, 沈红强等. 多参数流式细胞术观察251例白血病细胞cd14表达的意义. 实用肿瘤学杂志，2003；18：101-105

8cascavilla n, musto p, d'arena g, et ai. cd117 (c?kit) is a rest?ricted antigen of acute myeloid leukemia and characterizes early differentiative levels of m5 fab subtype. haematologica, 1998, 83 : 392-397

9weir eg, borowize mj. flow cytometry in the diagnosis of acute leukemia. semin hematol, 2001; 38:124-138

10刘艳荣,于弘,常艳等. 四色荧光标记抗体在白血病免疫分型中的应用及意义. 中国实验血液学杂志, 2002; 10 :423-427［］?