应用彩色多普勒及免疫组化技术检测人膀胱多发移行细胞癌中血管生成活性的意义

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[摘要] 目的 探讨术前检测多发膀胱移行细胞癌血管生成活性的意义,探讨其与盆腔淋巴结转移的关系。 方法 采用彩色多普勒血流显像(CDFI)技术检测21例术前膀胱癌患者血流信号定量测定阻力指数(RI),同时应用免疫组化技术检测膀胱癌术前活检组织和术后肿瘤内微血管密度(MVD),分析两者与盆腔淋巴结转移的关系。 结果 盆腔淋巴结转移组(LM+组)CDFI检测RI值明显低于无盆腔淋巴结转移组(LM-组),差异有显著性(P

[关键词] 彩色多普勒超声;膀胱癌;多发;阻力指数;新生血管

中图分类号:R445文献标识号:A文章编号:1005-0515(2010)09-046-02

【Abstract】 Objective To study the significance of angiogenetic activity examined before operation and investigate the relationship between angiogenetic activity and pelvic lymph node in human multiple bladder cancer. Methods Vascularizations of bladder cancer from 21 cases were observed by Color Doppler flow image to measure resistance index (RI).The microvessel density (MVD) of the biopsy specimen of the bladder cancer obtained before and after operaion was assessed by immunohistochemistry. Results The value of RI of pelvic lymph node metastasis group (LM+ group) was much higher than that of no pelvic lymph node metastasis group (LM- group) (P

[Key Words]Color Doppler Ultrasound bladder cancer multiple resistance indexangiogenesis

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,如美国2002年有56500例新诊病例[1]。其中以膀胱移行细胞癌多发(bladder transitional cell carcinoma,BTCC)[2]。肿瘤发生时,瘤灶及瘤周将会发生持续的、失控的血管生成;恶性肿瘤的发生、发展及转移的各阶段均有赖于新生血管的形成[3]。淋巴是肿瘤细胞转移的重要途径,50%以上的肿瘤细胞经淋巴转移。盆腔淋巴结是膀胱癌最主要的转移部位[2]。我们应用彩色多普勒血流显像技术(CDFI),结合免疫组化方法分别检测多发膀胱癌术前活检组织和术后肿瘤组织内微血管密度(MVD),探讨检测膀胱癌血管生成活性及与盆腔淋巴结转移的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择本科2005年5月至2008年7月住院治疗的多发膀胱癌患者21例,术前均未行放疗及化疗,术后病理证实为BTCC,G1、G2、G3期肿瘤分别为5、10、6例;Ta、T1、T2期肿瘤分别为4、11、6例。其中男15例,女6例,年龄51―83岁,平均63.5岁。均行膀胱全切加盆腔淋巴结清扫术,根据情况行肠代膀胱或输尿管皮肤造口。术后病理检查伴盆腔淋巴结转移者(LM+组)6例,无淋巴转移者(LM-组)15例。

1.2 主要试剂

多克隆羊抗小鼠CD31抗体,即用型HIGH-SABC免疫试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 CDFI检测膀胱癌血流

所有病人术前应用美国Gsteway Series型彩色多普勒超声诊断仪,探头频率7.5 MHz,二维切面观察膀胱大小、形态、内部回声及边缘情况。CDFI多切面观察肿瘤内部及周围血流,于血流显示最明亮处行脉冲多普勒取样,获稳定频谱后停祯,自动显示阻力指数(RI)数值,分别侧3条不同血管,采用最小RI值,界定值取0.40[4]。

1.4 免疫组化染色

术前膀胱镜活检组织和术后切除肿瘤组织标本分别用10%甲醛固定,石蜡包埋,应用SABC免疫组化法。采用多克隆羊抗小鼠CD31抗体,即用型HIGH-SABC免疫试剂盒,每一标本取两张4 μm厚石蜡切片,具体操作步骤参照CD31抗体和即用型HIGH-SABC免试剂盒说明书。PBS代替一抗做阴性对照,阳性对照为肿瘤包膜血管阳性染色。DAB显色,苏木精复染,树胶封片。使用Nikon照相显微镜,先在低倍光镜下(×100)将整个切片扫视一遍,选择出微血管生成(棕黄色染色)最多的区域,即血管生成热区,然后换至高倍光镜下(×200)计数血管生成热区中的CD31染色的所有血管内皮细胞[5]。每一组切片由两位观察者各自选择3个血管生成热区,共计数6个血管生成热区中的平均血管数,再除以每高倍光镜视野下的面积(0.015 mm2),即为MVD值。

1.5 统计学方法

应用t检验和直线相关性分析,P

2 结果

2.1 CDFI检测RI值

所有患者术前CDFI检测均得到满意的血流频谱。LM+组RI值≤0.40 5例(5/6,83.3%),LM-组RI值≤0.40 4例(4/15,26.7%)LM+组与LM-组的RI值比较有显著性差异(P

2.2 LM+组和LM-组术前活检与术后肿瘤组织内MVD比较

肿瘤微血管内皮细胞的细胞膜呈棕黄色着色为CD31染色阳性,微血管分布呈明显异质性,微血管丰富区多位于肿瘤边缘。6例LM+组术前活检组织MVD和术后肿瘤内MVD值均明显高于15例LM-组,差异有显著性(P0.05),见表1。

2.3 患者术前RI值与术后MVD计数的相关性分析

所有患者术前CDFI检测RI值与术后肿瘤组织内MVD计数有良好的负相关性(P

3讨论

肿瘤的生长依赖氧气和其他营养物质;早期主要依靠细胞的弥散方式获得氧气和其他所需营养物质,但这样的肿瘤结节直径不会超过2mm-3mm,细胞数小于107。如果没有进一步的血管生成,肿瘤细胞将因缺乏氧和其他营养物质而处于休眠状态。所谓肿瘤细胞休眠状态并不是指肿瘤细胞不再分化、增殖,而是肿瘤细胞增殖被同等速率的细胞凋亡所平衡。不过一旦肿瘤细胞获得血供,肿瘤细胞的增殖速率将大大超过凋亡速率,肿瘤便加速生长,且易发生浸润和转移[6]。MVD检测是反映血管生成状态的金标准[7]。CDFI技术能简便、直观检查肿瘤内血流信号。我们的实验结果显示CDFI检测的RI值在多发膀胱癌盆腔转移组与无转移组之间差异有显著性,提示CDFI对膀胱癌组织内血流检测可能为临床判断膀胱癌盆腔淋巴转移和预后提供一种较为简便的形态学指标。

BTCC初发时70-80%为表浅癌,其余20-30%往往发展为侵袭性和转移性癌。表浅癌术后60%以上复发,10年内42%肿瘤向高期、高级进展[8]。高发病趋势及易复发进展的特性决定了早期诊断和术后合理有效治疗的重要性。与大多数恶性实体肿瘤一样,BTCC的发生发展依赖于血管生成[9]。已有学者研究认为恶性肿瘤内MVD与肿瘤转移和预后具有高度相关性[10]。我们的研究结果显示多发膀胱癌术前活检组织和术后肿瘤组织MVD差异无显著性意义,膀胱癌术前活检组织和术后肿瘤组织中的MVD LM+组明显高于LM-组,提示微血管密度在判定膀胱癌生物学行为方面的一个独立指标,临床可采用术前活检肿瘤组织MVD预测膀胱癌盆腔淋巴转移和预后。

目前CDFI技术已较广泛应用于临床,我们的实验结果提示通过对肿瘤内部血流定量检测可以间接评估肿瘤内血管生成活性,将其与术前活检组织的MVD检测相结合,可以更好的评估多发膀胱癌内血管生成活性与转移预后等,而且对术中是否清扫盆腔淋巴结有指导作用。

参考文献

[1]Laufer M,Ramalingam S,Schoenberg MP,et al.Intravesical gemcitabine therapy for superficial transitional cell carcinoma of the bladder:a phase I and pharmacokinetic study[J].J Clin Oncol,2003,21:697-703.

[2]Ozen H,Hall MC.Bladder cancer[J].Curr Opin Oncol,2000,12:255-259.

[3]Teo NB,Shoker BS,Martin L,et al.Angiogenesis in pre-invasive cancers[J].Anticancer Res,2002,22(4):2061-2072.

[4]Buy JN,Ghossain MA,Hugol D,et al.Characterization of adnexal Masses:Combination of color Doppler and conventional sonography compared with Spectral Doppler Analysis Alone and Conventional Sonography Alone[J].AJR,1996,166(2):385-393.

[5] Ueda M,Ueki K,Kumagai K,et al.Apoptosis and tumor angiogenesis in cervical cancer after properative chemotherapy[J].Cancer Res,1998;58(11):2343-2349.

[6] Streeter EH,Harris AL.Angiogenesis in bladder cancer-prognostic marker and target for future therapy[J].Surg Oncol,2002,11(1):85-100.

[7] Offersen BV,Borre M,Overgaard J.Quantification of angiogenesis as a prognostic marker in human carcinomas:a critical evaluation of histopathologicalmethods for estimation of vascular density[J].Eur J Cancer,2003,39(7):881-890.

[8] Brausi M,Collette L,Kurth K,et al.Variability in the recurrence rate at first follow-up cystoscopy after TUR in stage Ta T1 transitional cell carcinoma of the bladder:A combined analysis of seven EORTC studies[J].Eur Urol,2002,41:523-531.

[9] Campbell SC,Volpen OV,Ivanovich M,et al.Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer[J].Cancer Res,1998,58:1298-1304.

[10] Goddard JC,Sutton CD,Furness PN,et al.A computer image analysis system for microvessel density in solid tumours[J].Angiogenesis,2002,5(1-2):15-20.