一测多评技术在热痹消颗粒质量评价中的应用

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摘要：目的 建立一测多评法的方法学考察方式，验证该方法在中药复方制剂热痹消颗粒质量控制中应用的可行性和技术适用性。方法 以热痹消颗粒为研究对象，建立小檗碱与黄柏碱、药根碱、巴马汀的相对校正因子，并将该校正因子应用于上述4种生物碱的含量测定，实现一测多评；同时采用外标法测定4种生物碱的含量，比较计算值与实测值的差异。结果 建立了热痹消颗粒中4种生物碱类成分一测多评法方法学的考察模式，一测多评法对不同的色谱柱和仪器的计算值与外标法实测值之间没有明显差异。结论 以黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱为指标，采用一测多评法控制热痹消颗粒质量是可行的。

关键词：一测多评法；相对校正因子；高效液相色谱法；热痹消颗粒

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0060-04

热痹消颗粒是江苏省中医院院内制剂，由黄柏、萆等8味中药组成，具有清热解毒、泻浊通络、消肿定痛之功效，主

治急性通风性关节炎及高尿酸血症、痛风性肾病等。黄柏中的生物碱类成分黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱均为活性药理成分，其中小檗碱对照品价廉易得，而黄柏碱对照品价高。目前，黄柏药材、饮片及含有黄柏的成方制剂主要以单指标成分（巴马汀或小檗碱）来控制质量，巴马汀或小檗碱在芸香科和毛茛植物中普遍存在，仅以单指标成分来进行质量控制，无法真实全面地评价黄柏及其成方制剂的内在质量。本试验采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定了黄柏中黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱的含量，并利用上述4种生物碱内在的函数和比例关系，采用“一测多评”的方法[1-4]，通过验证试验，以小檗碱为内标成分，得出黄柏碱、巴马汀、药根碱与小檗碱之间的相对校正因子，计算出这4种生物碱的含量，为真实评价黄柏以及含黄柏的中成药的质量提供全新的分析模式。

1 仪器与试药

Waters 2695-2996高效液相色谱仪，包括Empower工作站（Waters公司）；Agilent 1260高效液相系统，包括Agilent chemstation工作站（Agilent公司）；Agilent 1100高效液相系统，包括Agilent chemstation工作站（Agilent公司）、Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Welch Materials C18柱（250 mm×4.6 mm，18.5 ?m）、Hedera C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 ?m）；BP211D型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；KH-400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

热痹消颗粒，江苏省中医院制剂室生产；黄柏碱对照品，上海同田生物技术股份有限公司，批号09092921；盐酸小檗碱对照品，中国药品生物制品检定所，批号110713-200208；药根碱对照品，上海源叶生物技术股份有限公司，批号20101220；盐酸巴马汀对照品，中国药品生物制品检定所，批号110735-200907；乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 色谱条件 Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相A为乙腈，B为乙腈-0.1%磷酸水（36∶64，每1 000 mL中加入2 g十二烷基磺酸钠），梯度洗脱程序见表1。流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长284 nm。在上述色谱条件下，各组分分离度良好。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱各对照品适量分别置于25 mL量瓶中，制得各对照品的单一溶液。再分别精密吸取各对照品适量，置同一10 mL容量瓶中，流动相B溶液稀释至刻度，制得混合对照品溶液（黄柏碱62.23 ?g/mL，药根碱28.0 ?g/mL，巴马汀30.2 ?g/mL，小檗碱99.0 ?g/mL）。

2.1.3 供试品溶液的制备 取热痹消颗粒，研细，分别称取约1 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，加入流动相B，超声处理30 min（功率300 W，频率50 kHz），取出，放冷，用流动相加至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4 线性范围考察 精密吸取上述混合对照品溶液2、4、6、8、10、15、20 ?L进样分析，以进样量（?g）对峰面积积分值进行回归处理，分别得黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱回归方程Y=0.918 1X-2.520（r=0.999 9）、Y=2.891X-4.456（r=0.999 9）、Y=2.885 1X-3.450 5（r=0.999 9）、Y=2.786X-11.785 4（r=0.999 9）。四者分别在0.124～1.245、0.056～0.56、0.06～0.604、0.198～1.98 ?g范围内线性关系良好。

2.1.5 校正因子计算 以小檗碱为内参物，按下式计算黄柏碱、药根碱、巴马汀对小檗碱的相对校正因子（f ），结果见表2。

2.1.6 专属性试验 按处方量称取各药材，除去黄柏药材，按制备工艺制备成阴性供试品，再按“2.1.3”项下方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 ?L，分别注入液相色谱仪中，测定，色谱图见图1。试验结果表明，阴性对照无干扰。

2.1.7 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液10 ?L，连续进样6次，记录峰面积，黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱峰面积的RSD分别为0.28%、0.45%、0.27%、0.12%，表明精密度良好。

2.1.8 重复性试验 取热痹消颗粒约1 g，平行6份，精密称定，按供试品溶液处理方法制备样品，测定，黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱峰面积的RSD分别为0.65%、0.36%、1.08%、1.54%。

2.1.9 加样回收率试验 取0.5 g已知含量的样品粉末6份，精密称定，分别按各成分在制剂中的含量精密加入对照品溶液，相当于黄柏碱0.745 mg、药根碱0.060 mg、巴马汀0.071 mg、小檗碱3.47 mg，按供试品溶液处理方法制备样品，测定，计算加样回收率，结果见表3。

1.黄柏碱；2.药根碱；3.巴马汀；4.小檗碱

2.1.10 样品测定 分别精密吸取供试品、混合对照品及单一对照品（小檗碱）溶液各5、10、15 ?L注入高效液相色谱仪，测定。分别采用一测多评法和外标一点法计算热痹消颗粒中黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱含量。结果表明，采用一测多评方法及外标法所测得的热痹消颗粒中黄柏碱、药根碱、巴马汀和小檗碱的含量基本一致，说明本方法可行。

2.2 校正因子重现性考察

2.2.1 不同高效液相色谱仪上相对校正因子的考察 试验考察了Waters 2695-2998、Agilen1100、Agilent1260高效液相色谱系统，结果见表4。

2.2.2 待测组分色谱峰的定位 根据小檗碱的保留时间，利用目标峰对于小檗碱的相对保留时间，即可对峰进行定位。同样的成分，在不同的色谱柱及色谱仪器中的保留时间会有差异，但他们的光谱性质相同或相似，能通过对所有不同的流出时间点的光谱与纯物质之间的光谱实行比对，再结合目标峰所在原色谱簇的保留时间信息，即能正确判断出目标峰的准确峰位置。结果见表5、图2。

2.3 外标法和一测多评法结果比较

分别精密吸取不同批次的热痹消颗粒供试品溶液各10 ?L注入高效液相色谱仪，测定。采用外标法和一测多评法计算样品中黄柏碱、药根碱、巴马汀、小檗碱的含量，结果见表6。

3 讨论

目前，黄柏药材、饮片及含有黄柏的成方制剂主要以单指标成分（巴马汀或小檗碱）来控制质量。而小檗碱和巴马汀在芸香科和毛茛科植物中普遍存在，并且这2种生物碱的提取和合成工艺已相当成熟，很易购得纯品，若在制剂工艺中非法添加即能很容易符合质量标准的要求，所以，仅仅控制其中小檗碱或巴马汀的含量，无法真实地评价药物的内在质量。本试验以热痹消颗粒为研究对象，通过方法学试验、方法的耐用性试验及系统适应性试验，对一测多评方法应用于中药复方制剂的技术适应性及可行性进行了初步探讨。结果表明，采用一测多评法计算的含量结果与常规的外标试验方法所得的含量没有明显差异，采用一测多评法控制热痹消颗粒的质量是可行的。

由于十二烷基磺酸钠既不溶于乙腈又不溶于0.1%磷酸水。只有将其溶于乙腈-0.1%磷酸水（36∶64，每1 000 mL中加入2 g十二烷基磺酸钠）中超声约15 min方能溶解。故本试验采用2个流动相，并采用梯度洗脱，使待测成分分离良好。

试验中曾选用盐酸-甲醇（1∶100）、乙腈-0.1%磷酸水（36∶64，每1 000 mL中加入2 g十二烷基磺酸钠）、甲醇3种不同提取溶剂，超声、回流、索氏提取等不同提取方法，结果显示，以流动相B作为溶剂采用超声提取30 min（300 W，50 kHz），目标成分的提取效率高，干扰的杂质峰较少，并且色谱峰峰形对称。

本试验方法的关健是待测色谱峰的定位。中药制剂的复杂性决定了HPLC图谱中色谱峰会较多，因此，如何在众多的色谱峰中将待测色谱峰准确定位，是能否将一测多评方法成功应用的关健问题。同样的成分，在不同色谱柱及色谱仪器中的保留时间有些差异，但他们的光谱（或质谱）相同或相似。通过对所有不同流出时间点的光谱与纯物质之间的光谱匹配程度，再结合目标峰所在原色谱峰簇的保留时间信息，即能够正确判断出目标峰的准确峰位置。本试验待测峰的定位采用相对保留时间与光谱相结合的方法，定位准确，效果良好。

参考文献：

[1] 王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志，2006，31（23）：1925.

[2] 匡艳辉，朱晶晶，王智民，等.一测多评法测定黄连中5个生物碱的含量[J].中国药学杂志，2009，44（5）：390.

[3] 吴玉琼，胡芳弟，封士兰，等.高效液相色谱法测定香连丸及组方药材中5种活性组分的含量[J].分析测试技术与仪器，2009，15（4）：220-225.

[4] 尹萌，孟月兰，闻毓.关黄柏中生物碱类成分的“一测多评”[J].中草药，2011，42（6）：1093.

（收稿日期：2012-06-25，编辑：陈静）