青霉素种子罐工艺影响因素的研究

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摘　要：目的研究青霉素种子罐工艺的影响因素。方法以产黄青霉菌突变株，Penicillium chrysogenum 8621为实验菌种，优化种子罐培养工艺条件。结果获得了种子罐培养的最佳控制条件与最适移种时机。结论使用优化后的工艺条件，该菌株发酵生产青霉素的最终发酵效价提高了5％。

关键词：产黄青霉菌：青霉素；发酵：种子：优化

中图分类号：R978.1+1　文献标识码：A　文章编号：1672-979X(2010)11-0415-04

控制青霉素发酵过程是指在测量生产菌的环境条件和代谢变化参数的基础上，结合代谢调控基础理论，使生产菌沿着最佳轨迹代谢变化，实现以较低的能量和物料消耗生产更多的青霉素川。提高青霉素生产水平，一要不断优化发酵工艺技术，二要筛选生产菌种。优良菌种影响发酵全过程较大，是提高青霉素发酵效价的基础。本研究选择30m3通用型发酵罐作为种子罐，在原有工艺基础上使用Penicilliumchrysogenum 8621进行进罐实验。根据青霉素种子生长过程调整工艺，摸索种子罐培养工艺的最佳条件。

1　材料

1.1　实验材料

菌种Penicillium chrysogenum 8621(鲁南制药菌种选育中心)；蔗糖(食用级，广西凤糖)；玉米浆(工业级，华北制药)；硫酸铵、碳酸钙(分析纯，天津恒兴)；玉米油(食用级，金龙鱼公司)。　培养基组成(g／L)：蔗糖12，玉米浆75，碳酸钙10，玉米油0.8，硫酸铵3.5；配制方法：称量培养基各原料，投入种子罐，加纯化水，开启搅拌充分混合溶解，先按80％定容，加30％氢氧化钠溶液调pH6.10，定容。

1.2　设备

BX-30JS通用型发酵罐(上海保兴)。

2　方法

2.1　培养条件

灭菌后培养基pH 6左右；接种量：1.4亿米孢子／m3；罐温：25-26℃；罐压：0.04～0.06MPa；通气比1-3；周期70～75。

2.2　茵丝浓度测定

取摇匀的发酵液10札置于刻度离心管中，3000r／min离心10min，静置后读取菌体所占体积，该体积数值的1／10即菌丝浓度。

2.3　青霉素含量测定

用剩余碘量法嘲检测摇瓶效价。准确吸取离心后发酵液的上清，然后按摇瓶效价的高低分别稀释成不同的倍数。再取样品置入2个碘瓶中，分别作为空白和样品。

2.4　米孢子数计数

取1瓶250mL茄子瓶装的小米培养基的米孢子(小米25g)，全部倒出，用水定容至2000mL，搅匀，用规格25×16格的血球计数板在显微镜下计数，计四角和中间5个中格的孢子数，所得数据即为每瓶米孢子的亿数。

2.5　采用最初工艺种子罐培养

最初发酵工艺为：　(1)种子罐配方(g／L)：蔗糖12，玉米浆75，碳酸钙10，玉米油0.8，硫酸铵3:5：(2)种子罐的灭菌后体积约24m3；(3)接种孢子量：每立方米1.4亿以上；　(4)过程控制：温度25～26℃，压力0.05～0.06MPa，通气量1:3；(5)移种条件：菌丝浓度70％，周期60～65 h,oH值达最低点5.60时移种。

按上述条件运行，种子罐的过程表现为：50h前菌丝生长代谢较缓慢，pH变化不剧烈，菌丝浓度30％～50％；50h后pH值加速下降，菌丝浓度加速上升，60～65h时，pH降至5.6左右，菌丝浓度达到65％。分析种子罐代谢情况，要控制菌丝数量，防止菌丝过度分化，需熟练掌握影响种子罐的各种因素，找出最佳移种时机。

2.6　种子罐工艺的优化试验

2.6.1　孢子接种量对种子生长的影响在培养条件和控制条件相同的情况下，用不同的孢子接种量，观察和检测移种于发酵罐时种子的生长周期、菌丝浓度、pH的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的孢子接种量。

2.6.2　种子罐罐压对种子生长的影响在孢子接种量相同、培养条件相同的情况下，调整种子罐的罐压，观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的罐压。

2.6.3　温度对种子生长的影响在孢子接种量相同、培养条件和控制条件相同的情况下，调整种子的培养温度，观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的培养温度。

2.6.4　培养基浓度对种子生长的影响在孢子接种量与培养条件相同的情况下，通过降低培养基灭菌后的体积即增大培养基的浓度，观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的培养基体积。

2.6.5　种子罐移种条件的确定种子罐的移种标准即种子的最佳状态为：菌丝舒展、粗壮，菌丝浓度70％左右，pH值约5.60。

3　结果与分析

3.1　种子罐工艺的优化

3.1.1　孢子接种量对种子罐的影响孢子接种量是影响下一级发酵生产代谢的重要因素。接种量过大必然加剧孢子在发芽、生长、繁殖过程中对营养物质和溶氧的竞争，导致种子液中由于菌丝体数量多、营养不足而老化断裂、发酵活性差。孢子接种量、典型种子罐生长速度相关的数据和最终发酵数据见表1。

由表1可见，接种孢子数在1.0亿／m3左右时，发酵效价最高；小于1.0亿／m3时，种子罐中菌体生长相对较慢，生长周期长：大于1.0亿／m3时，种子罐中菌体生长相对较快，生长周期短，但两种情况下发酵效价均低于1.0亿／m3左右时，发酵效价比孢子接种量1.4亿／m3时提高了9.0％。

3.1.2　种子罐罐压对菌种生长的影响就耗氧发酵而言，溶氧水平是决定发酵成功的关键因素之一。在种子罐原控制工艺的基础上，用分段控制方法，即前40h降低罐压为孢子提供较低压环境，加快孢子发芽和生长速度：40h后提高罐压以抑制菌丝生长过快。调整前后典型种子罐的相关数据和最后发酵结果的据见表2。

由表2可见，降低种子罐前期的培养罐压，可以延长种子罐的生长周期，菌丝浓度相应增加，种子质量和发酵水平有较大幅度的提高。因此在种子培养过程中，分段控制种子罐的罐压：前40h为0.06 MPa，40 h后为0.10 MPa。发酵效价提高了4.2％。

3.1.3　温度对种子生长的影响微生物自身的酶系统活力在最适温度范围内才得以最大发挥，温度是影响微生物生长发育及代谢活动的重要因素。青霉素发酵温度一般为25～26℃，分别用25℃和26℃两种温度的种子罐培养，考察温度对新菌种生长代谢速度的影响，结果见表3。