中药材秦艽主要吸收成分群研究
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[摘要] 该研究通过制备大鼠外翻肠囊模型，并对其转运活性进行了确认，以秦艽中的马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷、以及当药苷为检测指标，用HPLC对经肠囊主动转运吸收后被吸收进入浆膜层的秦艽提取物中的主要成分群进行了分析，探讨了中药材主要吸收成分群的研究方法。结果表明所采用的大鼠外翻肠囊模型，在实验45 min内，组织结构完整，转运活性良好；HPLC的专属性和线性关系良好，精密度的RSD
[关键词] 中药材；秦艽；外翻肠囊；HPLC；吸收成分群
[收稿日期] 2013-06-04
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09308-003，2009ZX09301-005，2009ZX09502-021）；中央级公益性科研究院所基本科研业务费专项（22070833）
[通信作者] 朱晶晶，E-mail：
中医药是我国传统文化的瑰宝，长期中药研究实践表明中药具有成分众多、作用机制复杂的特点。如何从纷杂的成分中甄别主要有效成分，是中药临床实践中不可或缺的一个关键步骤。基于中药材可能存在着化学成分群>>吸收成分群>有效成分群的原则，中药材经胃肠道消化，并通过小肠吸收后的成分群将会直接影响着中药材的临床效果，因此，对于经口服方式发挥作用的中药来说，其消化性是决定该中药临床疗效的前提和基础，而对该中药经小肠吸收后的主要成分的定性、定量研究，是值得借鉴的中药材有效成分研究和评价的方法。本研究采用大鼠外翻肠囊（everted gut sac， EGS）模型[1-2]，并对肠囊的转运活性进行了确认；以中药材秦艽为研究对象，以其中的马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷、和当药苷为监测指标，用HPLC对秦艽提取物经空肠和回肠肠段主动转运吸收后，进入浆膜层一侧样品中的主要成分进行了分析，指认了吸收成分群中的部分主要成分。研究结果表明，大鼠外翻肠囊模型可以用来作为中药材吸收成分群研究与评价的有效方法。
1 材料
Wistar大鼠，雄性，体重（200±20）g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。合格证号SCXK-（京） 2009-0017，上述动物均以标准颗粒饲料饲养。
Agilent1260高效液相色谱系统（包括四元泵、柱温箱、自动进样器、DAD检测器和Agilent ChemStation 工作站，Agilent公司）；Agilent6320 HPLC-MS质谱仪（Agilent公司）；BF-2000氮吹仪，PSAN-8氮气发生器（北京中惠普分析技术研究所）；混合氧气瓶（95%O2，5%CO2）。
氯化钾，氯化钠，碳酸氢钠，磷酸二氢钠，葡萄糖，氯化镁，氯化钙（分析纯，北京化学试剂公司），乙腈（色谱纯，Dikma公司），甲醇（色谱纯，Dikma公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），乙酸（分析纯，北京化工厂）。
对照品龙胆苦苷（gentiopicroside，110770-201013）、当药苷（sweroside，111742-200501）、马钱苷酸（loganic acid，110770-201013），由中国食品药品检定研究院提供。当药苦苷（swertiamarian），由成都普思生物科技有限公司提供，纯度均大于98%。
秦艽（QinJiao， Genitana Macrophyllae Radix， GMR）药材，购自甘肃省天水，经上海中医药大学吴立宏副研究员鉴定为Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.的干燥根，符合《中国药典》（2010年版）秦艽项下规定的内容。
2 方法
2.1 样品制备
2.1.1 台氏液的制备 分别精密称取NaCl 8.0 g，KCl 0.28 g，NaHCO3 1.0 g，NaH2PO4 0.05 g，MgCl2 0.1 g，溶于500 mL蒸馏水中，密闭冷藏；精密称取CaCl2 0.2 g，溶于500 mL蒸馏水中，密闭冷藏；临用前，在不断搅拌下，将后者与前者均匀混合，加入葡萄糖 1.0 g，调节pH 7.4即得。
2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别精密取各对照品，用甲醇制备成一系列不同浓度的混合对照品溶液，对每个浓度的对照品，分别取200 μL混合溶液，加入200 μL台氏液；振荡混匀后，用氮气吹干，加200 μL甲醇，超声溶解；移取上清液，用0.22 μm滤膜滤过，备用。混合对照品溶液中，各对照品的质量浓度分别为马钱苷酸（8.78，70.14，175.4，350.7，701.4 mg・L-1）、当药苦苷（2.83，5.66，11.32，22.64，11.32 mg・L-1）、龙胆苦苷（10.01，50.05，100.1，200.2，2 002 mg・L-1）、当药苷（2.83，5.66，11.32，22.64，56.6 mg・L-1）。
2.1.3 供试样品的制备 将经氮气吹干后的供试样品，用200 μL甲醇，超声5 min，溶解，移取上清液，用0.22 μm滤膜滤过，备用。
2.2 大鼠外翻肠囊模型构建
2.2.1 大鼠外翻肠囊制备 于实验前1 d，大鼠禁食不禁水，过夜。大鼠经氟烷（halothane）麻醉后，实施剖腹手术，取出小肠，室温下，用生理盐水（0.9% saline）清洗，自小肠远端向十二指肠悬韧带一端，用玻璃棒轻柔地将小肠翻转过来。翻转后的小肠浸入经氧气饱和过的生理盐水中，每次实验用3根7.62 cm的肠囊，本研究中，小肠的回肠和空肠2个部分都用。制备好的肠囊用1 mL的台式液（浆膜液）充满，悬浮于30 mL同一种缓冲液中（黏膜液），置于培养箱内（95%O2，5%CO2），温度为37 ℃条件下，孵育[2]。
2.2.2 大鼠外翻肠囊组织病理学检查 将制备好的外翻肠囊在实验前以及外翻后孵育的不同时间点，分别截取部分肠囊样本，用石蜡固定，切片，并用苏木素（haematoxylin）和曙红（eosin）染色，采用普通研究用光学显微镜对肠囊结构的完整性进行检查。每个时间点，重复3只动物。
2.3 HPLC的方法学考察
2.3.1 色谱条件 AlltimaTM-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.8%乙酸水（B），梯度洗脱（0～15 min，10%A；15～20 min，10%A～15%A；20～25 min，15%A～30%A；25～30 min，30%A～35%A ；30～35 min，35%A～60%），柱温35 ℃，检测波长254 nm，流速1 mL・ min-1[4]。
2.3.2 专属性试验 比较空白台氏液、混合对照品溶液、供试品溶液的色谱行为，确定在马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷和当药苷的HPLC峰处，无其他杂质干扰测定。
2.3.3 萃取回收率试验 分别取上述制备好的高、中、低3个不同浓度混合对照品溶液，每一浓度制备5个样品，对每个样品，按照2.1项下的样品处理方法处理后，用HPLC测定其中各对照品的峰面积。另取3个相应的不同浓度的未经处理的对照品甲醇溶液，直接用HPLC测定其中各对照品的峰面积，用以下公式计算该样品处理方法的萃取回收率。
R=AtAs×100%（1）
R为萃取回收率，At为处理过的样品峰面积均值，As为未处理过的相应浓度样品峰面积均值。
2.3.4 线性关系考察 取10 μL处理后的混合对照品进样，用HPLC分析混合样品中，各对照品的峰面积。记录HPLC色谱图和峰面积，以峰面积（A）对各样品中对照品的质量（μg）做曲线分析，进行线性回归，求得标准曲线、回归方程、和相关系数。
2.3.5 精密度试验 分别制备高、中、低3种不同浓度的混合对照品溶液，高浓度混合液中，各对照品的质量浓度分别为马钱苷酸0.351 g・L-1、当药苦苷0.113 g・L-1、龙胆苦苷2.002 g・L-1、当药苷0.056 g・L-1；中浓度混合液中，各对照品的质量浓度分别为马钱苷酸0.071 g・L-1、当药苦苷0.023 g・L-1、龙胆苦苷0.401 g・L-1、当药苷0.026 3 g・mL-1；低浓度混合液中，各对照品的质量浓度分别为马钱苷酸0.018 g・L-1、当药苦苷0.006 g・L-1、龙胆苦苷0.101 g・L-1、当药苷0.006 g・L-1；按2.1项下试验方法，用HPLC对上述样品进行测定，每个样品重复测定5次，计算日内相对标准偏差；每个样品连续测定5 d，计算日间相对标准偏差，评价HPLC方法的日内和日间精密度。
2.3.6 稳定性试验 分别取上述制备好的高、中、低3种不同浓度的混合对照品溶液，在室温条件下，分别于存放0，8，16 h，按2.1项下试验方法，用HPLC分别测定各样品浓度。每个样品重复测定3次，将8，16 h的测定值平均值与零时测定值进行比较，评价样品中马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷、以及当药苷的稳定性。
2.4 大鼠外翻肠囊主动转运实验
将秦艽药材用95%乙醇提取，冷冻干燥，出膏率28%。临用前，用台氏液将秦艽提取物制备成3个不同质量浓度的混悬液，混悬液中生药含量分别为0.04，0.08，0.16 g・mL-1。将制备好的大鼠外翻空肠和回肠肠囊分别浸泡在不同浓度的混悬液内，分别于浸泡后的5，15，30，45，60，90，120 min，由肠囊内的充灌液（浆膜液）和浸泡液（黏膜液）中取出200 μL样品，用氮气吹干，按照供试样品的制备方法制备好，取10 μL滤液进样，用HPLC分别测定浆膜液和黏膜液中马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷、以及当药苷的的浓度，并计算浆膜液对黏膜液的浓度比率。
药物累计吸收量按公式2计算，吸收速率常数Ka按照公式3计算。Q为药物不同时间点的累积吸收量，Cn为不同时间点样品的实测浓度，V平衡为平衡时肠囊内灌入的台氏液体积，V样为每次取样的体积。以药物的累积吸收量对时间进行线性回归，得到斜率K，除以吸收面积A，得到吸收速率常数Ka（μg・h-1・cm-2）。以药物的累积吸收量（Q）对时间作相关分析，进行数学模型拟合，确定吸收模型，比较高、中、低浓度秦艽提取物中各主要成分的吸收速率常数（Ka）以及达到平衡状态时的吸收量之间的差异。
A.空肠肠囊；B.回肠肠囊；C.不同浓度秦艽提取物中部分主要成分在外翻肠模型空肠和回肠中的累积吸收量；D.不同浓度秦艽提取物中部分主要成分在外翻肠模型空肠和回肠中的Ka；a.15 min；b.30 min；c.45 min；d.60 min；e.90 min；f.120 min；1.马钱苷酸；3.6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷；4.当药苦苷；5.龙胆苦苷；6.当药苷；与低浓度比较1）P
图3 秦艽提取物大鼠外翻肠囊吸收试验（n=5）
Fig.3 Absorption test by the rat everted gut sacs on QinJiao extraction（n=5）
本研究所采用的HPLC检测方法，是本课题组在前期研究工作中所建立的针对马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷、以及当药苷的定量分析方法。实验结果表明：该HPLC可以用于秦艽中主要成分的定量分析研究，专属性良好，精密度RSD小于5.5%，样品处理方法的萃取回收率均在90%以上，样品中马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷、以及当药苷的含量与HPLC峰面积之间的线性关系良好，而且线性范围较宽，可以满足样品定量分析的要求。而且，在室温条件下，不同浓度样品8，16 h的稳定性RSD均小于14%，符合生物样品比较稳定的标准[8]。
中药材本身就是一个多种成分的复杂结合体，研究其中的有效成分，首先应该研究中药材提取物经小肠主动转运后，能够被吸收进入血液中的成分。而且，对中药材来说，可能存在着化学成分群>吸收成分群>有效成分群的原则，因此，消化特点决定了中药材的吸收成分群的特点，是中药材发挥疗效的基础[9]。大鼠外翻肠囊模型使研究中药材的消化特点成为了可能。本研究采用的大鼠外翻肠囊模型，包括空肠和回肠两部分，秦艽提取物中的主要成分经其主动转运后，被吸收进入浆膜液中，本研究在浆膜液样品中检测到了包括3种未知成分在内的共8种成分，提取物的浓度对上述主要成分的累积吸收量和吸收速率常数具有非常显著的影响，而提取物经不同肠段转运后的累积吸收量和吸收速率常数之间，没有显著差异。本研究建立的大鼠外翻肠囊模型，经结构完整性确认后，发现实验开始前以及开始后的45 min内，回肠肠段的组织黏膜层、黏膜下层、肌层及外膜层组织结构均正常，肠绒毛结构完整；90 min内，空肠肠段的组织黏膜层、黏膜下层、肌层及外膜层组织结构均正常，肠绒毛结构尚完整，因此，建议该外翻肠囊模型的最佳使用时间应控制在实验开始后的45 min以内。
秦艽提取物中目前已知的主要成分，在经肠囊主动转运吸收后的样品中均可以检测到。中药材车前子、白芍、川赤芍和银翘药对提取物中的主要成分也均能被肠囊主动转运吸收[10]。但是，龙胆提取物和复方吴茱萸汤中却存在着并某些有主要成分不能被大鼠外翻肠囊主动转运吸收的现象[11]，由此可见，肠囊对中药材中主要成分吸收的选择性是由哪些因素所决定的，应该是一个值得深入研究的问题。
综上所述，本研究制备了大鼠外翻肠囊模型，并对其转运活性进行了确认；用HPLC对秦艽提取物经外翻肠囊主动转运后的主要吸收成分群进行了探讨，其中包括马钱苷酸、当药苦苷、龙胆苦苷、当药苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、以及3种未知成分在内的共8种主要成分。同时发现提取物的浓度对各主要成分的吸收具有极其显著的影响，而不同肠段对主要成分吸收的影响，没有显著性差异。认为肠吸收技术可用于中药吸收成分群的研究与评价，可以为保证中药临床效果提供依据。
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Efficient method for analyzing absorbed ingredients of traditional
Chinese medicine Genitana Macrophyllae Radix
ZHU Jin-wu， SONG Bei， QU Wen-sheng， DONG Yan-sheng， YU Meng-sun， ZHU Jing-jing
（1.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；
2.Aviation Medical Institute， Air Force， Beijing 100142， China；
3.The Fourth Military Medical University， Xi′an 710032， China；
4.The Institute of Pharmacology and Toxicology， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）
[Abstract] In present study， a method for analyzing the absorbed ingredients of traditional Chinese medicine QinJiao has been developed.A rat everted gut sac （EGS） model has been established， and the transporting capacity of gut sacs was identified by histological examinations.The ingredients including loganic acid， sweroside， gentiopicroside， and swertiamarian in serosal solution absorbed by active transport of rat everted ileum and jejunum from Qinjiao extraction were determined using an HPLC method.Histological integrality of the gut sacs remains perfect and the active transport activity of them is normal within 45 min of the experiment.The HPLC method employed in this study presents high specificity and good correlation.The relative standard deviation of precision of this method is less than 5.5%.Extraction recovery of samples is more than 90%.And stability of the samples in room temperature is perfect.Eight ingredients of Qinjiao absorbed in serosal solution are identified.Furthermore， concentration of Qinjiao extraction significantly affects accumulated absorption and absorption coefficient of the ingredients.However， there is no significant impact on the accumulated absorption and absorption coefficient by diverse of everted gut sections.From above， the EGS techniques might be an efficient method， which can be employed for investigation of absorbed ingredients of Traditional Chinese Medicines.
[Key words] traditional Chinese medicine； Genitana Macrophyllae Radix； everted gut sac （EGS）； HPLC； absorbed ingredients
doi：10.4268/cjcmm20132235