miRNA―181a在系统性红斑狼疮患者血浆中的表达及临床意义
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[摘要] 目的 研究mirna-181a检测在系统性红斑狼疮患者临床诊治中的价值。 方法 采用反转录PCR法（RT-PCR）检测36例2015年1～6月来我院门诊和住院就诊的系统性红斑狼疮（SLE）患者及30例同期来我院健康体检的对照者的血浆miRNA-181a相对表达量，同时测定SLE患者的血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）与免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4及系统性红斑狼疮活动指数（SLEDAI）等，分析miRNA-181a与这些临床指标的关系。 结果 SLE组miRNA-181a相对表达水平显著高于健康对照组，SLE活动期组高于SLE稳定期组，差异均有统计学意义（P
[关键词] miRNA-181a；血浆；系统性红斑狼疮；临床指标；反转录PCR
[中图分类号] R593.241 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）32-0037-04
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫介导的以免疫性炎症为突出表现、常累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。SLE病因复杂，发病机制尚不明确，机体的免疫异常被认为是发病的关键原因。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类广泛存在于真核生物中、长度约21～25个核苷酸的非编码小分子RNA。它可通过与靶基因mRNA序列的特异性相互作用降解mRNA或抑制靶基因的翻译，还可在特定条件下上调靶基因的蛋白表达和mRNA水平。研究表明，在自身免疫性疾病的发生与发展过程中，microRNA发挥着不可忽视的作用[1]。
本研究采用实时荧光定量PCR法检测36例SLE患者和30例健康人群血浆的miRNA-181a相对表达量，并同时检测SLE患者血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4及系统性红斑狼疮活动指数（SLEDAI）等，分析miRNA-181a水平与这些临床指标的关系，探讨miRNA-181a在SLE疾病中的临床价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2015年1～6月来我院门诊和住院就诊的SLE患者36例，SLE诊断均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断指南，排除患有其他全身性疾病的患者。其中男7例，女29例，年龄23～61岁，平均（37±9）岁。系统性红斑狼疮活动指数（SLEDAI）≥6（活动期）21例，SLEDAI
1.2 仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪Roche Cobas Z 480购自美国Roche公司，Eppendorf D30紫外分光光度计购自Eppendorf公司，PCR引物由上海生工合成，Trizol RNA提取试剂、BIOGHC Elitefast SYBR Kit及BIOG Super Reverse Transcriptase均购自Invitrogell公司。
1.3实验方法
1.3.1 标本处理 取SLE患者静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，800 g离心10 min后吸取上清血浆至1.5 mL EP管中，再次800 g离心10 min，取上清血浆-80℃冷冻保存，统一检测。正常对照组标本处理同前。
1.3.2 总RNA的提取与纯化 用 Trizol RNA提取试剂盒提取和纯化总RNA，按试剂说明书操作。应用Eppendor D30紫外分光光度仪检测总RNA 浓度和质量，检测合格者置-80℃冰箱冻存待用。
1.3.3 miRNA-181a的逆转录 应用BIOG Super Reverse Transcriptase对提取的总RNA中miRNA逆转录成cDNA。按说明书将总RNA 5 μL加入反应体系，miRNA-181a逆转录反应条件：25℃ 5 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min；转录后得到的cDNA进行real-time PCR或-20℃保存备用。
1.3.4 Real-time PCR 在Cobas Z 480 PCR仪器上进行qRT-PCR。以小分子RNA U6作为内参，所用引物序列见表1。反应体系：cDNA 模板2 μL，2×BIOGHC Elitefast SYBR Master mix 10 μL，Primer Set 0.8 μL，加 RNase free ddH2O至20 μL。反条件：95℃ 5 min一个循环，95℃ 10 sec，60℃ 30 sec共40个循环，溶解曲线一个循环。实验重复3次，计算各标本平均Ct值。miRNA-181a的相对含量以2-ΔΔCt表示[3]，ΔΔCt=实验组ΔCt（目的基因 Ct-内参基因 Ct）-对照组ΔCt（目的基因Ct-内参基因Ct）。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，miRNA-181a的表达量与SLE临床指标的相关性采用pearson相关性分析，P
2 结果
2.1 SLE组和正常对照组血浆中miRNA-181a相对表达量比较
Real-Time PCR检测结果显示，SLE组miRNA-181a的相对表达量（0.68±0.19）显著高于对照组（0.41±0.15），差异有统计学意义（t=3.26，P=0.02
2.2 SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达量与一些常用临床指标的相关性
SLE活动期患者外周血浆中的miRNA-181a相对表达量显著高于稳定期患者，差异有统计学意义（t=4.13，P
3 讨论
miRNA-181作为micro-RNAs的一个家族系列，主要有miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d[4]。在人类中，miRNA-181主要在3个独立的染色体上编码，miRNA-181a-1/b-1位于1号染色体上，miRNA-181a-2/b-2位于9号染色体上，miRNA-181c/d位于19号染色体上[5]。miRNA-181家族成员的主要作用机制是通过与靶标mRNA的3’-UTR碱基互补结合，抑制其下一步的翻译功能，或者降低其互补mRNA的稳定性，达到调控相关基因的表达，进而参与各种生理或病理过程作用。miRNA家族成员在基因的功能上并不完全相同[6]，miRNA-181a作为miRNA-181家族中重要一员，在胞的发展和分化过程中起着尤为重要的作用，它能够抑制多种细胞增殖并促进细胞凋亡，且在不同组织细胞中具有表达差异[7，8]，研究发现其在癌症和自身免疫性疾病中常常出现异常高表达或低表达[9]。
系统性红斑狼疮作为一种慢性的多器官的自身免疫性疾病[10]，有多种临床表现型，病程活动期与稳定期呈迁延反复交替出现，严重者可导致死亡。在其发展过程中有多种炎症因子参与其中，如TNF-α、IL-1、IL-6和IFN等，这些炎症因子通过MAPK通路发挥作用[11]。在该病的发生和发展过程中，miRNA-181家庭均发挥着重要作用[12，13]。
关于miRNA-181a表达水平与SLE疾病的相关性目前有一些相互矛盾的研究结果[9，13-15]，我们利用RT-PCR方法检测了SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平，结果发现SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平显著高于正常对照组（P
本研究还分析了SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平与一些常见临床病理特征之间的关系，SLE患者血浆中miRNA-181a相对表达水平高低与患者年龄、性别、补体C3、C4浓度均无明显相关（P>0.05），miRNA-181a水平与SLEDAI积分、ESR、CRP呈正相关（P
综上所述，在SLE患者血浆中miRNA-181a的浓度增高，且与疾病的活动度相关，随着对miRNA-181a研究的不断深入，miRNA-181a有可能成为SLE早期诊断、临床活动度评价及预后判断的新的分子标志物。
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（收稿日期：2016-08-24）