β―胡萝卜素代谢调控研究
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摘要：研究了酮康唑、β-紫罗兰酮、表面活性剂和正十二烷对三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）发酵的生物量和β-胡萝卜素产量的影响。结果表明，酮康唑的最适添加量为30 mg/L，最适添加时间为接种后40 h。β-紫罗兰酮的最适添加量为0.10%，最适添加时间为接种后36 h。表面活性剂以span-20效果最好，最适添加量为0.10%，接种前加入。正十二烷的最适添加量为1.0%，接种前加入到发酵培养基中。
关键词：β-胡萝卜素；三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）；代谢调控
中图分类号：TQ920；O629.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）14-3694-03
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.14.038
Abstract： The effect of ketoconazole， β-ionone，surfactant and n-dodecane on the biomass and β-carotene yield of Blakeslea trispora were studied. The optimal addtiton of ketoconazole is 30 mg/L， its optimal adding time is 40 hours after inoculation. The optimal addtiton of β-ionone is 0.10%， its optimal adding time is 36 hours after inoculation. Span-20 is the most effective in the surfactants. Its optimal addtiton is 0.10%. It could be added into the medium before inoculation. The optimal addtiton of n-dodecane is 1.0%. It could also be added into the medium before inoculation.
Key words： β-carotene；Blakeslea trispora；metabolic regulation
β-胡萝卜素是联合国粮农组织和世界卫生组织一致认定的A类营养色素，不仅是人体内维生素A的重要来源，且具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、增强免疫等功能，在医药、食品着色及营养强化、日用化妆品及饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景[1]。目前，市场上的β-胡萝卜素产品主要有化学合成品和天然产品两种类型。天然β-胡萝卜素因其功能性强、安全性好及生物利用度高等优点而日益受到人们的青睐[2]。发酵法是目前生产天然β-胡萝卜素的主要途径。在可合成β-胡萝卜素的微生物中，三孢布拉氏霉无论是生物量（50 g干菌体/L），还是菌体细胞中β-胡萝卜素含量（可达菌体干重的1%～5%）都是最理想的，已成为目前国内外研究和生产天然β-胡萝卜素的主要菌种[3]。本实验室近年来一直致力于β-胡萝卜素的发酵制备研究，前期已完成了发酵条件优化[4]、菌种选育[5]以及菌体中β-胡萝卜素的提取[6]等方面的研究。本研究旨在探索各种代谢促进剂对三孢布拉氏霉合成β-胡萝卜素的影响，以期进一步提高β-胡萝卜素的发酵产量，从而为今后的产业化打下一定的基础。
1 材料与方法
1.1 菌种
三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）正菌是从中国典型培养物保藏中心购买的原种，负菌是从中国典型培养物保藏中心购买的原种经本实验室诱变选育所得的突变菌株。
1.2 培养基
PDA培养基：新鲜马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、自来水1 000 mL， pH自然。
种子培养基：葡萄糖5%、大豆粉1%、1%麸皮浸出液、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4，pH 7.0。
发酵培养基：玉米粉4%、大豆粉1%、1%麸皮浸出液、0.1% KH2PO4、 0.05% MgSO4、0.01% 维生素B1 、1%植物油，pH 7.0。
1.3 菌种活化培养
将保藏的三孢布拉氏霉正、负菌分别接种至新鲜的PDA斜面培养基上，26 ℃培养3 d。
1.4 种子培养
将活化好的三孢布拉氏霉正、负菌分别接种至三角瓶种子培养基中，26 ℃、180 r/m培养36 h。
1.5 发酵培养
将培养好的正、负菌株液体种子（菌丝）分别接种至三角瓶发酵培养基中。接种量为10%，正负菌的接种比例为1∶9，26 ℃、180 r/m发酵培养120 h。在发酵培养的不同时间点加入不同量的代谢促进剂，检测其对生物量和β-胡萝卜素产量的影响。
1.6 生物量及β-胡萝卜素产量的测定
生物量及β-胡萝卜素产量的测定见参考文献[5]。
2 结果与分析
2.1 酮康唑对β-胡萝卜素发酵的影响
唐琼[7]通过麦角固醇抑制剂酮康唑对三孢布拉氏霉菌异戊二烯合成途径代谢调控的研究发现，添加适量浓度的酮康唑可促进番茄红素的产量。由于番茄红素是类胡萝卜素进一步合成代谢的分支点，其中一条途径是在番茄红素β-环化酶的作用下产生β-胡萝卜素，故考虑添加酮康唑来研究其对三孢布拉氏霉生物量和β-胡萝卜素产量的影响。
从图1可以看出，在接种发酵40 h后加入不同浓度的酮康唑，对生物量没有太大的影响，说明40 h后三孢布拉氏霉菌丝体基本上都已长好。但对β-胡萝卜素的产量具有明显的影响，当酮康唑的添加量为30 mg/L时，β-胡萝卜素的产量最高，故以该添加量研究不同添加时间对β-胡萝卜素产量及生物量的影响。
从图2可以看出，前期加入酮康唑对三孢布拉氏霉菌丝体的生长具有明显的抑制作用，β-胡萝卜素的产量也相应较低。36 h后加入对生物量已没有太大的影响，β-胡萝卜素的产量也趋于稳定。因此，酮康唑的添加时间以接种发酵40 h为宜。
2.2 β-紫罗兰酮对β-胡萝卜素发酵的影响
β-紫罗兰酮（β-ionone）在结构上与β-胡萝卜素相似，二者均具有β环，因此最初人们认为β-紫罗兰酮是β-胡萝卜素前体，在细胞内可转化成β-胡萝卜素。但后来的研究表明，β-紫罗兰酮的作用是解抑制甲羟戊酸激酶，从而促进β-胡萝卜素合成[8]。
从图3可以看出，接种发酵40 h后加入不同浓度的β-紫罗兰酮时对菌丝体生物量影响不大，而对β-胡萝卜素产量却有明显的影响。当添加0.10% β-紫罗兰酮时，β-胡萝卜素产量达到最大，因此，β-紫罗兰酮添加剂量确定为0.10%。
从图4可以看出，随着β-紫罗兰酮添加时间的推迟，生物量和β-胡萝卜素产量均有上升趋势，表明前期菌丝体生长时加入β-紫罗兰酮对菌丝生长和β-胡萝卜素合成有抑制作用。接种36 h后添加0.10% β-紫罗兰酮时β-胡萝卜素产量达到最大，因此β-紫罗兰酮添加时间确定为接种后36 h。
2.3 表面活性剂对β-胡萝卜素发酵的影响
在发酵液中添加适当的表面活性剂，不仅可以改变发酵液的流体特性，增加溶氧，而且可以改变细胞的通透性，增加胞内外物质平衡从而有利于物质传递。离子型表面活性剂对细胞具有较强的杀伤作用，一般添加非离子型表面活性剂较好。
从图5可以看出，接种前在发酵培养基中分别加入0.10%的不同表面活性剂，对三孢布拉氏霉菌丝体的生物量影响不大，但β-胡萝卜素产量以添加span-20效果最好，故选择添加span-20表面活性剂。
从图6可以看出，接种前在发酵培养基中分别加入不同浓度的span-20，当添加浓度低于0.10%时，生物量没有明显的影响，当高于0.10%时，生物量略有所下降，说明span-20添加过量，对三孢布拉氏霉菌丝体的生长还是有一定的抑制作用。β-胡萝卜素产量以0.10%添加浓度时最高。
2.4 氧载体对β-胡萝卜素发酵的影响
氧载体与发酵液形成的体系具有氧传递速度快、能耗低、泡沫生成少、剪切力小等特点，能在不增加能耗的基础上提高氧传递效率，不仅适合于好氧高密度发酵，也适合于溶氧功耗高或因剪切力作用大而难以进行大规模培养的脆弱细胞培养，同时也可应用于固定化生物催化剂好氧反应中[9]。三孢布拉氏霉菌是高好氧菌，因此，利用氧载体提高发酵液中溶氧具有重要的意义[10]。本试验主要研究了正十二烷对β-胡萝卜素发酵的影响。
从图7可以看出，接种前在发酵培养基中分别加入不同浓度的正十二烷，随着正十二烷浓度的增加，β-胡萝卜素产量呈先上升后下降趋势，说明过高浓度的正十二烷不利于菌丝体合成β-胡萝卜素，1.0%的正十二烷添加到发酵培养基中β-胡萝卜素产量及生物量均达到最大，因此正十二烷浓度确定为1.0%。
从图8可以看出，随着正十二烷添加到发酵培养基中时间的推迟，β-胡萝卜素产量逐渐降低，表明越早加入正十二烷越有利于提升发酵液溶氧水平从而利于β-胡萝卜色素合成。正十二烷不同添加时间对菌丝体生长影响不大，因此正十二烷可直接先添加到发酵培养基中。
3 讨论
三孢布拉氏霉合成β-胡萝卜素的途径已经研究清楚，研究人员为了提高β-胡萝卜素的产量，在菌种选育及培养基和发酵条件优化方面进行了大量的探索研究，β-胡萝卜素的产量也得到了不同程度的改善和提高。β-胡萝卜素的生物合成受合成细胞自身的代谢控制，为了提高其产量，最有效的办法就是从遗传的角度打破微生物细胞的正常代谢控制机制。然而，人们目前对内源类胡萝卜素合成的相关酶基因在生物细胞中如何表达及调控知之有限，这使得在调控类胡萝卜素生物合成的基因工程研究方面因缺乏理论基础而带有一定的盲目性。尽管已有研究者将β-胡萝卜素合成途径的关键酶基因导入到细菌或酵母菌中，并成功的合成出了β-胡萝卜素，但由于新的宿主细胞中缺乏三孢布拉氏霉菌丝中所特有的脂溶性油囊结构，使得新宿主细胞承载β-胡萝卜素的能力有限，因而工程菌合成β-胡萝卜素的产量依然偏低[11]，现有的β-胡萝卜素生物合成代谢调控依然以三孢布拉氏霉自身细胞为主。
参考文献：
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