缺血再灌注损伤与细胞凋亡及相关基因Bcl-2
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缺血再灌注损伤是各种器官及组织移植过程中导致早期失去功能的最主要原因。近年来，越来越多的研究证实，细胞凋亡是造成移植物缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式。现将缺血再灌注损伤时细胞凋亡及相关基因B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cell lymphoma/leukemia-2,bcl-2)以及其调控机制的相关研究进展综述如下。
1细胞凋亡的概念
细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，是细胞生命周期中的重要组成部分。这一概念是1972年由澳大利亚组织病理学家 Kerr[1]首先提出，Apoptosis一词本意是花瓣或树叶从花或树上掉落或凋落，而Kerr借用它来形象地描述一种特殊类型的细胞死亡即凋亡。它是一种具有独特的形态学和生化改变的、与坏死截然不同的另一种死亡方式；是一个主动的高度有序的经基因严密调控的一系列酶参与的过程，可见于胚胎发育、组织发生、组织分化及细胞癌变等过程[2］。
2细胞凋亡的特点
细胞凋亡描述的是单个细胞的死亡，其典型的形态学改变是[3]：细胞体积缩小、胞质凝缩，内质网疏松并与胞膜融合；核糖体等聚集，但无结构破坏，染色质固缩，密度增高并集聚于核膜周边，嗜碱性增强，核仁裂解，继而细胞膜出泡、内陷，将细胞自行分割成多个具有膜包裹的凋亡小体（apoptosis body）。凋亡小体最后被巨噬细胞或临近吞噬细胞吞噬，或排入体腔如腺腔及血管腔等[4]。整个过程无细胞质的外泄，故不引起炎症反应及周围组织的次级损伤。而细胞坏死是细胞死亡的另一种方式，其特点与细胞凋亡不同，主要表现为膜通透性增加，细胞外形不规则变化；内质网扩张，核染色质位移，细胞器和核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，胞浆外溢，坏死细胞被巨噬细胞所吞噬，引起周围组织不同程度炎症反应。因此细胞坏死一般是成片发生的，在形态上易与细胞凋亡相区别。
细胞凋亡的生化特征主要是细胞内发生一系列信号传递反应，以染色体脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid,DNA）被激活的核酸内切酶有控降解为突出特征。基因组DNA发生有规律的不可逆性降解，核小体之间的连接部双螺旋DNA被特异性钙离子/镁离子（Ca2＋/Mg2＋）依赖的DNA内切酶断裂成含180～200 个碱基对（base pair,bp）的多倍寡核小体片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈典型的梯状(ladder)条带。利用这一特点，可以检测凋亡细胞的存在 ［5-6］。
3缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）损伤时的细胞凋亡现象
既往普遍认为组织I/R损伤后最终必将引起细胞死亡，即坏死，但近年来的研究表明，细胞凋亡是在I/R损伤早期的细胞死亡形式，且在I/R损伤的病理过程中起着重要的作用。
3.1 肝脏I/R损伤与细胞凋亡：Borghi等[7]观察了16例临床原位肝移植术后细胞凋亡情况,整个切片肝细胞凋亡指数为18.7%，肝被膜下区为30.4%，小叶中央区为14.5%，门静脉周围区10.3%。并指出，肝细胞凋亡指数与冷缺血时间无关，而与术后天门冬氨酞转氨酶水平呈正相关，与血清V因子水平呈负相关。故认为，肝移植术后出现较多的细胞凋亡可能与肝脏I/R损伤有关。Gao等[8]研究发现单纯冷保存肝16h，未发现凋亡细胞，而保存8h及16h后分别予以含氧再灌注1h则肝窦内皮细胞的凋亡细胞数显著增加，故认为肝窦内皮细胞凋亡是肝移植I/R损伤造成移植肝失去功能的主要原因。张浩等[9]研究表明大鼠冷灌注保存及再灌注后肝脏均有肝细胞凋亡发生，且呈阶段性。在冷灌注保存肝组织中可检测到bax及Fas，未检测到Bcl-2，肝移植再灌注后肝组织中可检测到bax、Fas及Bcl-2。Rentsch等[10]研究也证实随着冷灌注保存及再灌注时间的延长大鼠移植肝细胞凋亡数显著增加，而且bax表达增强，而天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3(MACH/FLICE)表达降低。
3.2 脑I/R损伤与细胞凋亡：Li等[11]在大鼠局灶性脑缺血模型中，采用凋亡细胞原位末端标记―TUNEL（TDT-mediat dTUP nick end labeling）法观察了缺血10～20min再灌流48h后细胞凋亡发生的情况，结果表明，人脑中动脉阻断90～120min后再灌流48h，凋亡细胞大量出现在梗塞灶的内边缘区。MacManus等[12]在大鼠全脑缺血模型中发现，12min缺血后，纹状体和海马分别于缺血第1、2天出现梯形DNA电泳条带，并且随时间的延长，出现以单体(200 bp)和双体(400 bp)为主的DNA条带，大脑皮层于缺血第3天亦出现类似结果。因此认为，全脑缺血再灌注引起的神经元损伤不属于坏死，而是包含着凋亡机制。Tomingn等[13]证实，在局灶性脑缺血时，神经元的凋亡和坏死同时存在。
3.3心脏I/R损伤与细胞凋亡：Fuss等[14]采用原位末端标记(ISEL)和琼脂糖凝胶电泳证实，在缺血和I/R大鼠心肌有典型的凋亡形态学改变和DNA梯形条带，认为缺血和I/R心肌均可发生细胞凋亡。心肌细胞的凋亡与缺血及I/R持续时间长短有关。Gottieb等[15]研究发现兔I/R心肌细胞呈现DNA梯形条带及核染色质浓缩，而正常或缺血兔心肌细胞无此现象，提示心肌细胞凋亡是再灌注心肌损伤的特征之一。Panizo等[16］的研究证实心脏移植术后的凋亡细胞与缺血再灌注损伤有关。
3.4 肺I/R损伤与细胞凋亡：Stammberger等[17]的研究证实大鼠移植肺的凋亡指数与冷保存时间无关，与移植缺血再灌注损伤有关，且移植物含氧再灌注2h肺细胞凋亡达到高峰，其后逐渐降低。Fischer等研究发现大鼠肺冷保存20min、6h及12h后细胞死亡率＜2%，而保存18h及24h后细胞死亡率则分别为11%及27%，细胞死亡方式主要为坏死。以上时间段冷保存的肺移植后再灌注2h，细胞死亡方式则发生变化，6h及12h组约有30%细胞凋亡，仅有2%的细胞坏死。而18h及24h组分别有30%及29%的细胞坏死，仅有1%细胞凋亡。移植后肺功能检测的结果表明其与保存时间及坏死细胞百分比负相关。因此认为细胞凋亡是移植肺缺血再灌注损伤早期细胞死亡的主要方式之一，对肺功能的影响远较细胞坏死低。
3.5 肾I/R损伤与细胞凋亡： Burns等[18]通过对11例接受活体供肾及25例接受尸肾的肾移植患者的研究发现尸肾移植后凋亡细胞数明显高于活体供肾，而且尸肾冷保存30h移植后凋亡细胞数明显高于冷保存24h以内。因此认为肾移植术后的凋亡细胞与肾缺血再灌注损伤有关。
4Bcl-2与细胞凋亡及调控机制
细胞凋亡与增殖的动态平衡是细胞维系其结构稳定和内环境功能平衡及生长发育最基本的生物学过程, 细胞凋亡受自身基因调控，随着分子生物学的发展，近年来发现许多基因的表达与凋亡有关，且新的凋亡基因不断被发现，它们之间存在着复杂的关系。目前，对细胞凋亡相关基因及调控机制的研究已成为生命科学的前沿和热点,其中Bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控倍受瞩目。
Bcl-2于1985年由Tsujimoto等研究滤泡性非何杰金B细胞淋巴瘤时发现在染色体转位时可以激活一种基因即Bcl-2基因。Bcl-2编码蛋白由239个氨基酸残基组成,分子量26KD,其34～80位氨基酸残基突变率很高,而两侧的氨基酸序列相对保守。Bcl-2在进化过程中有高度保守的倾向,Bcl-2蛋白功能也相对保守,从原虫到人细胞Bcl-2都有阻断细胞凋亡功能。对Bcl-2一级结构进行分析,未发现典型的信号传导或跨膜蛋白特异序列,但在其羧基末端发现了疏水性氨基酸序列。人、大鼠、鸡的 Bcl-2蛋白近羧基端有1段19个氨基酸羧基组成的疏水区,在此疏水区外侧仅有两个带电残基,这两个残基作用是将19个氨基酸残基锚定在细胞膜性结构上。突变研究证明,Bcl-2蛋白疏水区插入膜性结构中,从而使Bcl-2分子球形结构伸向胞质中,并证实这种插入对Bcl-2分子发挥阻止细胞凋亡有重要作用[19]。Bcl-2蛋白可表达于正常细胞的激活和发育过程中,在成熟组织中亦有表达,在走向凋亡的细胞中低表达或不表达。Bcl-2蛋白可存于免疫、神经、内分泌系统等正常组织中,也可存在于人体多种形态的肿瘤组织中。
目前已发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类：①象Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、线虫Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等；②具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri[21]。Bcl-2抑制细胞凋亡的机理尚不完全清楚，目前认为的机理有以下几种：
①Bcl-2蛋白的细胞定位：Bcl-2蛋白是一种与细胞器特别是线粒体膜相关的蛋白,它主要位于线粒体外膜、核被膜和内质网膜,其C-末端一段疏水氨基酸对其功能非常重要,改变其中的氨基酸可使其生物活性大大降低[20]；②Bcl-2和Ca2+：Bcl-2蛋白在内质网有分布,高浓度的Bcl-2蛋白可以抑制正在发生凋亡的细胞内质网中Ca2+的释放,因此认为Bcl-2干扰Ca2+释放可能是Bcl-2抗凋亡机制之一；③Bcl-2和细胞转运：Bcl-2通过直接或间接地与细胞信号传递蛋白作用而调控细胞凋亡。最新研究表明,Bcl-2可以改变P5和Cdc2及CDK2细胞周期调节蛋白的核-胞浆转运。Bcl-2与编码P53基因的共表达可延缓P53诱导的凋亡,从而阻断P53诱导的凋亡和生长停止；④Bcl-2和氧自由基：Bcl-2在线粒体的大量分布,提示可能与氧代谢有关,氧化代谢过程中可以产生自由基,自由基又是凋亡诱导剂之一,有研究表明,细胞在接受多种凋亡诱导刺激后Bcl-2表达大量增加,并且能减轻自由基造成的结构破坏,Pau1等发现Bcl-2能阻止脂质过氧化物的形成,抑制氧化诱导的细胞凋亡,Bcl-2的抗氧化和抑制自由基产生作用,是其阻止细胞凋亡的另一机制；⑤Bcl-2相互作用蛋白：对Bcl-2结合蛋白和Bcl-2同源蛋白的研究,使人们对Bcl-2抑制凋亡的机制有了新的认识。Bcl-2和Bax既可以以同源二聚体形式存在,也可以形成异源二聚体。Bcl-2、Bax和Bcl-x三者形成了一个凋亡调控系统:当Bax同源二聚体形成,便诱导凋亡。随着Bcl-2蛋白表达量上升,越来越多的Bax二聚体分开,与Bcl-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-Bcl-2异源二聚体,从而“中和”了Bax-Bax诱导凋亡的作用,即Bcl-2与Bax的比例调节了凋亡的发生。而当Bcl-xs存在时,优先与Bcl-2形成异源二聚体,使游离Bax得以形成同源二聚体诱导凋亡。这一模型也许可以解释为什么Bcl-2表达并不一定抑制某些细胞的凋亡作用。另外Bad与Bcl-x1形成异源二聚体,可阻止Bcl -x1对凋亡的抑制,而Bad与Bcl-2的结合不能阻止对凋亡的抑制。当Bad与 Bcl-x1形成稳定的异源二聚体后,使原来的Bax-Bcl- x1解体,将Bax置换出来,形成Bax同源二聚体,启动凋亡。Bax、Bad、Bcl-x1模式与Bax、Bcl- xs、Bcl -2模式极为近似,两者共同点为Bax最终导致凋亡。Bcl-2和Bcl-x1通过与Bax结合抑制凋亡,Bcl-xs和Bad通过与Bcl-2和Bcl-x1的结合置换Bax,启动凋亡。这一模式很可能是Bcl-2家族作用于凋亡过程的基本模式[21]；⑥抑制胞膜磷脂酰丝氨酸早期重分布：凋亡中的一个重要现象就是凋亡细胞膜磷脂酰丝氨酸 (Phosphatidylserine,PS)的暴露。正常情况下PS位于胞膜内侧,凋亡早期PS广泛易位至胞膜外侧从而使吞噬细胞得以识别凋亡细胞。由于胞膜PS的早期重分布是凋亡的一个共同特征,而Bcl-2恰恰能够抑制PS的这种变化,从而提示Bcl-2可能通过抑制PS的外在化而阻止凋亡[22]；⑦通过参与信号传递而抑制细胞凋亡：R-RasP23、R-RasP21、Raf-1、NO等都是重要的信号传导分子,同时也参与细胞凋亡的调节,这些分子或可与Bcl-2结合,或可调节Bcl-2表达,Bcl-2参与这些分子相关的信号传导通路,通过影响这些通路而抑制细胞凋亡。近年来人们又发现Bcl-2可参与IL-2R介导的信号传导通路,使抗原特异性T细胞免受γ射线和地塞米松诱导的凋亡。
5展望
缺血再灌注损伤是一种受多方面因素影响的病变过程，这一病变过程可引起细胞凋亡，同时细胞凋亡又是缺血再灌注损伤造成组织、器官失去功能的主要原因。由于细胞凋亡受基因调控，因此，为我们研究减轻缺血再灌注损伤、提高移植物的成活率开辟了一条新的治疗途径。在调控细胞凋亡的众多基因中，Bcl-2基因家族在抑制细胞凋亡方面起到了重要作用，通过调高抑制凋亡基因的表达，或者阻断凋亡信号的传导途径，均可达到减轻甚至消除缺血再灌注对组织、器官的损伤作用。随着研究的不断深入，有望寻找到更加有效的防治缺血再灌注损伤的药物。
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[收稿日期]2008-03-31[修回日期]2008-06-04