七氟醚抑制人红细胞抗氧化能力的实验研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇七氟醚抑制人红细胞抗氧化能力的实验研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要] 目的 观察七氟醚对人红细胞抗氧化能力的影响，探讨其作用机制。 方法 健康成年人红细胞制成2%悬液，分为8组：单纯空气组（A组）、1%七氟醚组（S1组）、3%七氟醚组（S3组）、5%七氟醚组（S5组）、空气+过氧化氢（H2O2）组（A+H组）、1%七氟醚+H2O2组[（SI+H）组）]、3%七氟醚+ H2O2组（S3+H组）、5%七氟醚+ H2O2组[（S5+H）组）]，各组通醚时间为30 min，孵育15 h后，加入反应浓度为200 μmol/L H2O2，继续孵育3 h后检测溶血率、过氧化氢酶（CAT）及丙二醛（MDA）含量，所得数据用SPSS 13.0软件统计处理。 结果 （S3+H）组溶血率（%）（17.384±1.976）比（A+H）组（10.848±0.274）和S3组（12.417±0.716）明显增加（P = 0.007，P = 0.027）。与A组（17.301±4.222）相比，S3组（5.431±0.531）和S5组（5.175±0.658）CAT含量（U/mgHB）明显降低（P = 0.009，P = 0.009）。（S1+H）组（4.319±0.235）、（S3+H）组（8.257±1.389）和（S5+H）组（9.156±0.742）CAT含量均较（A+H）组（13.689±2.003）明显降低（P < 0.05）。而MDA含量（μmol/gHB）（S1+H）组（3.547±0.898）和（S3+H）组（4.474±0.653）均比（A+H）组（2.654±0.509）增高（P = 0.031，P = 0.021）。 结论 七氟醚可降低红细胞抗氧化能力，其机制与抑制过氧化氢酶活性有关。

[关键词] 七氟醚；过氧化氢；红细胞；溶血

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0025-04

七氟醚是目前临床常用的吸入麻醉剂，属卤代烃基醚，广泛地应用于临床全身麻醉手术。红细胞膜富含不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸对自由基诱导的过氧化非常敏感。内源性反应不断产生自由基，高水平的外源性或内源性自由基可能导致细胞结构的主要组成部分受到破坏，包括核酸、蛋白质类、氨基酸、脂类以及碳水化合物，并可能影响细胞的多种功能，如细胞膜功能、代谢甚至基因表达，并导致一系列其他病理状态[1-2]。抗氧化剂是机体对抗自由基及氧化因素的防御机制[3]。活性氧族（ROS）与防御、修复机制之间的平衡失调导致了氧化应激的产生[4]。

有文献报道[5]，应用七氟醚与异丙酚麻醉相比，患者术后24 h红细胞计数前者明显较低，七氟醚浓度为1.5最低肺泡有效浓度（MAC）时血红蛋白明显降低[6]，这是否与七氟醚降低红细胞抗氧化能力，导致的自由基对红细胞的损伤有关，目前报道较少。红细胞的氧化应激及抗氧化能力可通过多种指标进行检测，如脂质过氧化的终产物丙二醛（MDA）[7]。细胞及细胞膜脂质对氧化反应的敏感性可通过应用氧化剂诱导氧化反应，进而检测MDA的产生量[8-9]。故本实验以健康成人红细胞为研究对象，采用体外培养方式，以低浓度过氧化氢（H2O2）为损伤因素，通过对红细胞溶血率、过氧化氢酶（CAT）及MDA含量的检测来观察七氟醚对红细胞抗氧化能力的影响并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及试剂 新鲜血液（B型，符合《中华人民共和国献血法》健康检查标准的2011年12月21日献血者捐献的血液标本），液态七氟醚（江苏恒瑞公司），30% H2O2（批号110618，北京海德润制药有限公司），林格氏液（批号：11062502A1，陕西省康乐制药厂），5%葡萄糖液（批号：11071704B1，陕西省康乐制药厂），蒸馏水，CAT含量试剂盒（南京建成公司），MDA含量试剂盒（南京建成公司）。

1.1.2 试验用仪器及设备 麻醉机（欧美达Avance，美国欧美达公司），七氟醚挥发罐、麻醉气体采样管（随麻醉机附带），酶标分析仪（RT-6000，深圳雷杜公司），160C型医用低速离心机（白洋公司），THZ-95型台式恒温震荡培养箱（北京四环科学仪器厂），带胶塞10 mL灭菌瓶，三通开关，1000 μL微量加样器，50 mL离心管，5 mL离心管，96孔板，封口胶。

1.2 方法

1.2.1 含糖林格氏液配置 按体积比52∶1在林格氏液中加入5%葡萄糖液。使溶液含氯化钠145 mmol/L、氯化钾4 mmol/L、氯化钙2 mmol/L、葡萄糖5 mmol/L，pH=7.4。

1.2.2 配制红细胞悬液及实验分组 用抗凝采血管采集成年非吸烟健康志愿者外周静脉全血12 mL，枸橼酸钠抗凝，于4℃，2500 r/min离心5 min，去除血浆，取下层红细胞，林格氏液10 mL洗涤，相同条件下再次离心5 min，并重复2次。取离心好的4 mL红细胞压积加进含糖林格氏液，配成2%红细胞悬液200 mL，用吸管吹打成均匀的红细胞悬液，用微量加样器将配好的红细胞悬液加入灭菌瓶，红细胞悬液分为8组：空气组（A组）、1%七氟醚组（S1组）、3%七氟醚组（S3组）、5%七氟醚组（S5组）、空气+ H2O2组[（A+H）组]、1%七氟醚+ H2O2组[（S1+H）组]、3%七氟醚+ H2O2组[（S3+H）组]、5%七氟醚+ H2O2组[（S5+H）组]，另设阳性对照及阴性对照组（测溶血率用），每组4个平行对照样本，每瓶4 mL（阳性对照组及阴性对照组每瓶2 mL），盖好胶塞，封口胶密封待用。

1.2.3 悬浮红细胞液通七氟醚 取密封好实验瓶，将两根导管插入胶塞，导管开口处接三通开关，一根导管接麻醉机，另一根导管通大气，通气方法见图1。

麻醉机选用手控模式，氧含量为21%（空气），总流量为0.5 L/min。依据麻醉气体采样管显示浓度，按上述七氟醚浓度各组通气30 min后，关闭三通，放入恒温震荡培养箱中50 r/min，37℃孵育15 h。

1.2.4 H2O2处理通醚后的红细胞 取出孵育后的红细胞，按上述分组方式加入30%的H2O2，使终浓度为200 μmol/L进行处理，不加H2O2组加入等体积的林格氏液作为对照，继续孵育时间为3 h。

1.2.5 实验指标测定 取出孵育后的红细胞，采2 mL红细胞液用林格氏液按照红细胞悬浮液∶林格氏液=4∶5比例稀释，阳性对照组加入2.5 mL蒸馏水，阴性对照组加入林格氏液2.5 mL，37℃孵育30 min。各组样本移入5 mL离心管，2500 r/min离心5 min，取各样本上清液300 μL，加入96孔板，应用酶标仪在415 nm处测定吸光度值，每个样本测3次。

溶血率=（实验组吸光度- 阴性组吸光度）/（阳性组吸光度- 阴性组吸光度）×100%。

当样品溶血率小于0时，溶血率以0计。

其余2 mL红细胞液委托北京华英生物技术研究室进行红细胞中CAT、MDA含量的测定。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用One-Way ANOVA方法分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组溶血率实验结果

结果显示，S3组溶血率[（12.417±0.716）%]大于S1组[（10.949±0.265）%]和S5组[（10.561±0.128）%]，差异有统计学意义（P = 0.038，P = 0.017，P < 0.05）；S1、S3、S5组与A组数据间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。（S3+H）组溶血率[（17.384±1.976）%]大于（A+H）组[（10.848±0.274）%、（S5+H）组[（9.777±0.576）%]和S3组，差异有统计学意义（P = 0.007，P = 0.007，P = 0.027，P < 0.05）。见表1。

2.2 各组CAT含量实验结果

A组CAT含量[（17.301±4.222）U/mg HB]与S1组[（13.534±1.906）U/mg HB]比较，差异无统计学意义（P = 0.217），但高于S3组[（5.431±0.531）U/mg HB]和S5组[（5.175±0.658）U/mg HB]，差异有统计学意义（P = 0.009，P = 0.009）。（A+H）组CAT含量[（13.689±2.003）U/mg HB]高于（S1+H）组[（4.319±0.235）U/mg HB]、S3+H组[（8.257±1.389）U/mg HB]、S5+H组[（9.156±0.742）U/mg HB]，差异有统计学意义（P = 0.002，P = 0.021，P = 0.048）。且（S1+H）组VAT含量高于S1组，S3组VAT含量高于（S3+H）组，S5组CAT含量高于（S5+H）组（P < 0.05）。见表2。

2.3 各组MDA含量实验结果

A组、S1组、S3组、S5组组间数据比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。（S1+H）组MDA含量[（3.547±0.898）μmol/g HB]大于（A+H）组[（2.654±0.509）μmol/g HB]，差异有统计学意义（P = 0.031 < 0.05）；（S3+H）组[（4.474±0.653）μmol/g HB]大于（A+H）组，差异有统计学意义（P = 0.021 < 0.05）。其他组间数据比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

生物的代谢过程中，氧分子在线粒体呼吸和（或）胞浆代谢中发生不完全还原反应产生ROS[10]。包括H2O2、羟自由基和超氧阴离子等，它们可以破坏生物大分子如生物的脂膜、核酸和蛋白质等而产生严重的生物效应，如谷胱甘肽的耗竭、脂质过氧化及蛋白质和核酸的氧化等[11-12]。红细胞内ROS的主要来源为血红蛋白（Hb）。其产生机制为，Hb中的血红素铁与氧之间的Fe-O键极化后，Hb发生自发氧化产生过氧化物。而红细胞自身存在一系列酶可保护细胞免受ROS的损伤。这些酶主要包括Cu-Zn超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（CAT）、高铁血红蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和一类新出现的抗氧化酶同源家族peroxiredoxins（Prxs）[13]。

CAT是一类以铁卟啉为辅基的结合酶，具有较强的自由基清除功能，对组织的氧化损伤有防护作用[14]。H2O2在CAT的作用下转化为水和分子氧[15]，CAT在灭活H2O2的同时消耗增加，从而造成其活性下降。MDA为脂质过氧化终产物，测试MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度[7-9]。

H2O2是细胞在有氧环境中的代谢产物，是一种主要的活性氧分子，具有重要的生物学功能，包括充当信号分子，调节细胞分裂、分化、迁移、衰老或死亡[16]。H2O2诱导细胞氧化损伤的程度，主要取决于氧化应激因素的强弱。对内皮细胞研究发现，大剂量H2O2（>0.5 mmol/L）以引起内皮细胞坏死为主，而小剂量H2O2（

综上所述，七氟醚可抑制人红细胞CAT活性，降低红细胞抗氧化能力，其临床意义有待进一步研究。

[参考文献]

[1] Young IS，Woodside JV. Anti-oxidants in health and disease [J]. Clin Pathol，2001，54：176-186.

[2] Gutteridge JM. Lipid peroxidation and anti-oxidants as biomarkers of tissue damage[J]. Clin Chem，1995，41：1819-1828.

[3] Maurizio M， Luciano A， Walter M. The microenvironment can shift erythrocytes from a friendly to a harmful behavior： Pathogenetic implications for vascular diseases[J]. Cardiovascular Research，2007，75：21-28.

[4] Antolovich M，Prenzler PD，Patsalides E，et al. Methods for testing antioxidant activity [J]. Analyst，2002，127：183-198.

[5] Tsuchiya M， Asada A， Kasahara E， et al. Antioxidant protection of propofol and its recycling in erythrocyte membranes[J]. Am J Respir Crit Care Med，2002，165（1）：54-60.

[6] 杭燕南.当代麻醉与复苏[M].上海：上海科学技术出版社，1994：4.

[7] Rumley AG，Paterson JR. Analytical aspects of anti-oxidants and free radical activity in clinical biochemistry[J]. Ann Clin Biochem，1998，35：181-200.

[8] Stocks J，Dormandy TL. The autoxidation of human red cell lipids induced by hydrogen peroxide [J]. Br J Hematol，1971，20：95-111.

[9] Cynamon HA，Isenberg JN，Nguyen CH. Erythrocyte malondialdehyde release in vitro： a functional measure of vitamin Estatus[J]. Clin Chim Acta，1985，（151）：169-176.

[10] Bae YA， Cai GB， Kim SH， et al. Modular evolution of glutathione peroxidase genes in association with different biochemical properties of their encoded proteins in invertebrate animals [J]. BMC Evol Biol，2009，9（4）：72-84.

[11] Park SG， Cha MK， Jeong W， et al. Distinct physiological functions of thiol peroxidase isoenzymes in Saccharomyces cerevisiae[J]. Biol Chem，2000，275（8）：5723-5732.

[12] Rhee SG， Chae HZ， Kim K. Peroxiredoxins： a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling[J]. Free Radic Biol Med，2005，38（12）：1543-1552.

[13] Manta B， Hugo M， Ortiz C， et al. The peroxidase and peroxynitrite reductase activity of human erythrocyte peroxiredoxin 2[J]. Arch Biochem Biophys，2009，484（2）：146-154.

[14] 王凯军，姚克，徐雯.N2乙酰-L2半胱氨酸和过氧化氢酶抑制晶状体上皮细胞凋亡及对caspase23酶活性的影响[J].中华眼科杂志，2003，39（9）：555-559.

[15] 张克烽，张子平，陈芸.动物抗氧化系统中主要抗氧化酶基因的研究进展[J].动物学杂志，2007，42（2）：153-160.

[16] Veal E， Day A. Hydrogen penroxide as a signaling molecule[J]. Antioxid Redox Signal， 2011，15（1）：147-151.

[17] Burlacu A， Jinga V， Gafencu AV， et al. Severity of oxidative stress generates different mechanisms of endothelial cell death[J]. Cell Tissue Res，2001，306（3）：409-416.

[18] 曹晨，叶博，魏国，等.丙泊酚抑制过氧化氢诱导人红细胞衰亡[J].国际麻醉学与复苏杂志，2012，53（5）：322-325.

（收稿日期：2013-06-07 本文编辑：卫 轲）