增殖细胞核抗原及凋亡相关基因蛋白在肺鳞癌中的表达及意义
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作者：张瑾，李海，康培良，汪继勇，陈芳，张阳
［摘 要］ 目的：分析增殖细胞核抗原（PCNA）、Bclxl、Bak蛋白在肺鳞癌中的表达，探讨其与肺鳞癌发生、发展的关系。 方法： 应用免疫组化法对40例肺鳞癌组织中PCNA、Bclxl、Bak蛋白的表达进行观察和分析。结果： PCNA在肺鳞癌中的阳性表达率显著高于正常支气管黏膜（P<0.05）。Bclxl在肺鳞癌中的阳性表达率显著高于正常支气管黏膜（P<0.05）。Bak在肺鳞癌中的阳性表达率显著低于正常支气管黏膜（P<0.05）。随着肿瘤分化程度的降低，肺鳞癌中PCNA的阳性表达呈上升趋势，而Bclxl及Bak的阳性表达呈下降趋势。 结论：PCNA、Bclxl、Bak都参与了肺鳞癌的形成和发展，因此，有效地控制细胞的增殖与凋亡，对肺鳞癌治疗有重要的研究价值，可为肺鳞癌的治疗提供新的思路。联合检测PCNA、Bclxl、Bak在评估肺鳞癌的发展及判断转移趋势方面均具有重要意义。
［关键词］ 肺；鳞癌；增殖；凋亡；增殖细胞核抗原；Bclxl；Bak
恶性肿瘤的发生、发展及转移与细胞增殖和分化失常有关。细胞凋亡是由于细胞内外环境变化或死亡信号激发以及在基因调控下所引起细胞主动死亡的过程，其发生是细胞受促进性和抑制性双向因素共同调节的结果。Bcl2基因家族是细胞凋亡的重要调节者，因其功能特点又分为抗凋亡蛋白家族如Bclxl和促凋亡蛋白家族如Bak。本研究应用免疫组化方法检测肺鳞癌组织中增殖细胞核抗原（Proliferating cell nucler antigen, PCNA）和凋亡相关基因蛋白Bclxl、Bak的表达，旨在探讨PCNA、Bclxl和Bak基因产物在肺鳞癌发病机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 选择本院2000年至2005年胸外科手术切除的肺癌石蜡标本40例。均经HE染色，病理组织学确诊。其中男27例，女13例，年龄37岁～60岁。对照组为正常支气管黏膜20例。
1.2 方法 肺癌标本均经10%的甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚4 μm～5 μm，载玻片经多聚赖氨酸处理，防止脱片，微波抗原修复。兔抗人Bclxl多克隆抗体（工作浓度1∶50），兔抗人Bak多克隆抗体（工作浓度1∶50），鼠抗人PCNA单克隆抗体（工作浓度1∶50）。免疫组化试剂盒、DAB显色剂试剂盒均购自福州迈新公司。PBS冲洗、DAB显色、苏木素复染、常规脱水透明、树胶封片，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果 阳性细胞为呈棕黄色或棕褐色颗粒的反应产物，光镜下任取4个高倍视野进行细胞计数，至少计数200个细胞，以阳性细胞占细胞总数的百分比表示阳性表达程度。0~5%为阴性（-）；6%~10%为弱阳性（+）；>10%为阳性（++）。
1.4 统计方法 两组间率的比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
PCNA在肺鳞癌及正常支气管黏膜上皮中的表达：以细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达；Bclxl在肺鳞癌及正常支气管黏膜上皮中的表达：以细胞浆或核膜上中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达；Bak在肺鳞癌及正常支气管黏膜上皮中的表达：以细胞浆或核膜上中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达；Bclxl、Bak 、PCNA在肺鳞癌中的表达情况比较及相关分析，见表1、表2。
表1 Bclxl、Bak、PCNA在肺鳞癌和正常肺组织中表达（略）
表1提示：肺鳞癌中Bclxl蛋白表达较正常支气管黏膜明显升高，差异有显著性（P<0.05）。肺鳞癌中Bak蛋白表达较正常支气管黏膜明显降低，差异有显著性（P<0.05）。肺鳞癌中PCNA蛋白表达较正常支气管黏膜明显升高，差异有显著性（P<0.05）。
表2 Bclxl、Bak、PCNA与肺鳞癌病理分级的关系（略）
上表提示：随着肿瘤分化程度的降低，肺鳞癌中PCNA蛋白的阳性表达升高，差异有显著性（P<0.05），而Bclxl蛋白的阳性表达降低，差异有显著性（P<0.05），Bak蛋白的阳性表达降低，差异有显著性（P<0.05）。
3 讨论
物质合成和细胞增殖的活跃是肿瘤发生发展的重要基础，而肿瘤组织发生发展的重要原因之一是细胞异常增殖和凋亡失衡。我院该项研究的重点放在对PCNA、Bclxl和Bak表达的观察与分析上，旨在进一步探讨其发病机制，为更好的治疗方案提供新的思路。肿瘤的发生、发展与细胞增殖周期调控密切相关。PCNA是DNA复制所必需的调节蛋白，是一种了解细胞周期在特定时间细胞核内表达一定特异抗原的相关蛋白，其在各种恶性肿瘤中均有过度表达的报道［1］。PCNA的合成和表达代表着细胞的增殖状态，是细胞处于增殖周期的一个客观生物学指标，作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与了细胞的增殖活性［2］，在静止期的细胞内含量很少，从G1晚期开始增加，S期达高峰，G2期、M期明显下降。因此，PCNA的阳性程度可直接反应出DNA复制的活跃程度。通过研究PCNA的表达，可以了解肿瘤细胞的增殖状态，其含量越高，肿瘤细胞的增殖也就越活跃，故被认为是一种准确简便且可直观了解细胞增殖状况的研究指标。本研究结果显示，在正常组织中，PCNA的表达较低，随着肿瘤的发生和恶性程度的提高，PCNA的表达明显增强，呈明显的正相关关系，P<0.05。说明PCNA是肺鳞癌进展的重要指标，其表达越强，肺癌的分化程度越差，可较好地预示肿瘤的生物学行为，与文献报道相符［3］。提示PCNA在肿瘤的发生发展中有加速细胞增殖作用，并促进肿瘤的恶性进程。因此，对PCNA的研究可为肺鳞癌的临床治疗提供新的思路。近年来研究表明，肿瘤的发生不仅取决于细胞的异常增殖，细胞凋亡异常也具有重要作用。目前细胞凋亡即细胞程序性死亡已经成为肿瘤病因学的研究重点。在从线虫到人类不同有机体细胞凋亡的研究中逐步认识到，凋亡的发生是受抑制性和促进性因素的双向调节的，如果调控机制紊乱，则可引起多种如恶性肿瘤的疾病。近年来对细胞凋亡的研究主要集中于细胞凋亡的相关基因，而Bcl2基因家族是其中的典型代表［4］，其中Bclxl和Bak是近几年发现的Bcl2家族成员的代表，Bak和Bclxl都是Bcl2基因家族的成员。在人体各组织中均有广泛表达，其中Bclxl为抑凋亡蛋白，而Bak为促凋亡蛋白。Bclxl是独立于Bcl2蛋白以外的抑制凋亡的蛋白，与Bcl2蛋白具有拮抗性的表达，功能与Bcl2相似，能与Bak蛋白形成异二聚体，中和Bak的促凋亡作用，从而抑制细胞凋亡。Bak是Bcl2家族中又一促凋亡基因，它编码一个由216个氨基酸组成的蛋白质，与Bcl2蛋白有28%的同源性，与Bclxl结合后影响其下游的信号传导，从而中和Bclxl的抑制凋亡作用，也能不依赖与Bclxl形成异二聚体的作用而独自发挥促凋亡的作用。由此可见，Bclxl和Bak是凋亡密切相关的基因。Bclxl抑制凋亡必须通过与Bak形成异二聚体来实现，二者的比例决定细胞接受凋亡信号后的存活与否。如果Bclxl表达水平下降，则会无法平衡促凋亡基因Bak的作用，可使细胞走向凋亡，反之，如果Bak表达水平下降，细胞凋亡将会受到抑制。Bak作为Bcl2基因家族促凋亡基因的代表，在本实验中显示其在肺鳞癌中表达较正常肺组织中明显减少，尤以低分化鳞癌更明显，可见Bak基因表达下调与肺鳞癌的发生密切相关。由于Bak基因表达减少，正常细胞的凋亡受到抑制，使鳞状细胞寿命延长，凋亡减少，从而促使肿瘤的发生。在高分化鳞癌中，由于细胞分化较好，角化珠形成，在角化珠中鳞癌细胞较成熟，此时Bak还能够发挥部分作用，促进肿瘤细胞凋亡，达到限制肿瘤生长的目的，而低分化肺鳞癌细胞由于分化较差，癌细胞多处于不成熟状态，Bak表达较少且无法发挥其功能，所以肿瘤细胞失去抑制，具有旺盛的生命力，不断增殖并向周围浸润。说明Bak蛋白表达对防止癌细胞转移、扩散具有积极意义。Bak在预后好的高分化癌病例中表达多，预后差的低分化癌病例中表达少，提示Bak蛋白表达能够促进细胞凋亡，进而在一定程度上阻止肺鳞癌进展，最终延长肺鳞癌患者生存时间。肺鳞癌组织中抑凋亡基因的表达与患者术后生活质量密切相关， Bclxl在Bcl2家族中与Bcl2功能相同，参与细胞凋亡的抑制作用。目前普遍认为Bclxl与Bak可形成二聚体，共同参与凋亡的调控。本研究结果显示，肺鳞癌组织中Bclxl的表达比正常肺组织增多，说明Bclxl抑制细胞凋亡，以逃避机体正常的清除异常基因机能，可能是肺鳞癌发生的原因之一。Bclxl在胃癌和食道癌中的表达水平同肿瘤的分化水平呈负相关，肿瘤分化越好，Bclxl表达越强［5］，本实验证明肺鳞癌也符合这一规律。本实验中Bclxl的表达在分化降低的过程中，Bclxl有下调的趋势，因此上调Bclxl可能有助于鳞状细胞癌的早期进程并抑制肿瘤分化。本研究中，随着肿瘤分化程度的降低，Bclxl表达强度也降低，这与其他人得到的Cl2蛋白在食道癌和直肠腺癌早期损伤中过表达的结果相一致［6］。因为Bclxl蛋白可有效的抑制凋亡，在高分化的细胞中可呈过量表达，发挥促进肿瘤生长的作用。在低分化癌中可能由于肿瘤迅速生长导致一些肿瘤的拮抗因子活化，从而抑制了Bclxl蛋白的表达。提示Bclxl的过量表达抑制Bak的作用，使上皮细胞的凋亡受到抑制，从而趋向增生和分化活跃。本研究显示，Bclxl与PCNA在正常支气管黏膜中均呈少量表达，在肺鳞癌组织中均呈高表达，表明在细胞凋亡受到抑制的同时，常可显示高增殖状态，提示在Bclxl与PCNA的上游还存在重要的调节因素。可见在肺鳞癌的发生、发展过程中，细胞的失控性增生与凋亡的异常在肺鳞癌的发生、发展中起了重要作用。可以认为，肺鳞癌的发生是多种因素参与的复杂的病理过程，增值细胞核抗原（PCNA）、凋亡调控基因Bclxl、Bak都参与了肺鳞癌的形成和发展，其发生是多基因多步骤协同作用的结果。因此，有效地控制细胞的增殖与凋亡，对肺鳞癌治疗有重要的研究价值，可为肺鳞癌的治疗提供新的思路。联合检测PCNA、Bclxl、Bak在评估肺癌的发生、发展及判断转移趋势和估计预后方面均具有重要意义。
参考文献：
［1］ 李锦清，张昌卿，张亚奇，等.PCNA、p53蛋白在肝癌临床中的意义［J］.癌症,1996；15(1)：45.
［2］ 康凯夫，杜长春.P53、PCNA、 KI67在星形细胞瘤中的表达与分化及预后的关系［J］.中华病理学杂志；1998；27（4）：303.
［3］ 高进，刘晓雨，计雪梅，等.增殖细胞核抗原与癌基因在肺癌中的表达及意义［J］.齐齐哈尔医学院学报，2000，21(3)：243.
［4］ Korsmeyer S J. Bcl2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death［J］.Blood 1992:80(4):87986.
［5］ Takayama T, Nagao M, Sawada H, et al.BclX expression in esophageal squamous cell carcinoma; association with tumor progression and prognosis ［J］. Jsurg Oncol 2001;78(2)11623.
［6］ Krajewska M, Moss SF ,Krajewski S, et al.Elevated expression of BclX and reduced Bak in primary colorectal adenocarcinomas ［J］ .Cancer Res 1996;56(10):24227 .