CaMKII在脊髓背角LTP中调节

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【摘要】 【目的】 研究钙/钙调素调依赖性蛋白激酶II(camkii)在大鼠脊髓背角C纤维诱发电位长时程增强(ltp)中对α-氨基羟甲基异恶唑丙酸(AMPA)受体GluR1亚单位磷酸化的影响,探讨长时程增强的分子机制。【方法】 利用电生理和Western blot 方法,检测脊髓背角LTP后30 min 和3 h AMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845位点磷酸化水平,同时在强直刺激前,脊髓局部给予CaMKII特异性抑制剂KN-93,检测GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平变化。【结果】 强直刺激后30 min、3 h,脊髓背角AMPA受体GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平明显增加。 脊髓背角局部给予KN-93,阻断了LTP的诱导并且也阻止了GluR1亚单位Ser831和Ser845磷酸化水平的增加。【结论】 强直刺激可导致GluR1亚单位Ser831和Ser845激活且它的激活可能是通过CaMKII来实现的。

【关键词】 钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ; 长时程增强; GluR1; KN-93; 磷酸化作用; 脊髓背角

[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):241-245] 长时程增强(long-term potentiation, LTP)是突触传递效率的长时程增强,海马LTP被认为是学习和记忆的突触模型[1],由于C纤维与脊髓背角浅层神经元形成突触联系传导伤害感受信息[2],因此电刺激C纤维或者是神经损伤引起的脊髓背角LTP被认为是痛记忆的一种形式[3],一些在海马LTP中起关键作用的细胞内信号转导途径,如蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、钙调依赖性蛋白激酶II(CaMK II)等,在脊髓背角LTP中也有作用[4,5]。由于CaMK II在中枢神经系统中分布广泛,且在与记忆有关的海马脑区密度非常高,因此CaMK II被认为是与LTP和记忆最为密切的激酶[6]。CaMK II的磷酸化对于海马LTP是非常关键,它的激活可导致细胞内Ca2+ 浓度升高,且抑制剂可阻止LTP诱导。CaMKII的激活能够磷酸化AMPA受体[7],从而提高它的单通道电导性。

AMPA受体是GluR1~GluR4 4个亚单位组成的多聚体,在海马LTP中介导快速的突触电流[8]。在所有的AMPA受体亚单位中,GluR1对于成熟动物海马LTP的建立非常重要 [9]。GluR1有两个主要的磷酸化位点,Ser831和Ser845,它们的磷酸化作用可改变AMPA受体的功能。体外研究已经证实,CaMK II可以使GluR1 Ser831发生磷酸化,而PKA可磷酸化Ser845位点[10]。

脊髓背角C纤维诱发电位LTP与海马LTP和中枢敏感化有相同的机制[11]。然而,在脊髓LTP中,目前还没有证据显示GluR1哪一个位点被激活,我们先前的研究已经发现CaMK II在脊髓LTP的诱导和维持起关键作用,但CaMK II是否也影响AMPA受体的磷酸化水平[5],这依然不太清楚。因此,本研究将检测(1) 脊髓背角LTP期间, GluR1可能被激活的位点;(2) 强直刺激后,脊髓局部应用CaMK II选择性抑制剂KN-93是否抑制GluR1磷酸化水平的升高。

1 材料和方法

1.1 实验动物与试剂

体质量250~280 g的SD雄性大鼠,由中山大学实验动物中心提供,分笼饲养。KN-93购于sigma公司,溶解于少量二甲亚枫(DMSO),配制成1 mmol/L的储存液,后用ACSF稀释成工作浓度(100 μmol),DMSO的终浓度不超过0.5%。

1.2 手术准备及电生理记录

乌拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉,行常规气管插管和颈静脉插管,在腰4~腰6(L4~L6)间行椎板切除[文秘站:]术,暴露腰膨大。游离左侧坐骨神经,使用双极氯化银电极刺激坐骨神经。除用于记录的脊髓节段外,暴露的神经组织均用石蜡油覆盖。颈外动脉插管持续监测动脉血压10.67~13.33 kPa(80~100 mmHg)。用热反馈系统使大鼠肛温维持在37.0~37.5 ℃。 脊髓背角C纤维诱发电位的记录方法如文献所述[12]。用钨丝微电极(电阻0.5~1 MΩ)进行细胞外记录,电极深度在脊髓表面下100~500 ?滋m。用数/模转换器(DT2821-F-16SE)以10 kHz的速度处理和储存数据。以C纤维诱发电位的幅度作为参数。单方波(10~20 V,0.5 ms,1 min-1 )刺激分离的左侧坐骨神经诱发脊髓背角电位,强直刺激(40 V,0.5 ms,100 Hz,持续1 s,间隔10 s, 4次)诱导C纤维诱发电位LTP。坐骨神经的刺激点到脊髓背角的记录点约为11 cm。

1.3 Western blotting

方法如文献所述[5,13],分离大鼠L4~L6段脊髓,取刺激同侧脊髓背角,于pH 7.6、15 mmol/L Tris buffer 的裂解液中匀浆,裂解液成份见文献,冰上超声。4 ℃, 13 000 × g 离心15 min ,取上清。加样于SDS-PAGE凝胶上,200 V电泳45 min,后100 V、1 h转至PVDF膜上,室温封闭1 h,一抗孵育1 h(1 ∶ 1 000,phospho-GluR1 at Ser831 and phospho-GluR1 at Ser845 antibody),漂洗3次,用耦合辣根过氧化物酶的二抗孵育1 h,漂洗3次,ECL显色1~3 min,曝光。计算机灰度扫描,定量分析。

1.4 统计学处理

实验结果用SPSS 10.0统计软件处理,所用数据用均数±标准差表示,用非参数检验比较均数间差异。取?琢=0.05。