抗生素论文：骨科抗生素对细胞的效果透析

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作者：曹峥 侯树勋

发现万古霉素毒性更低。Antoci等比较了环丙沙星、妥布霉素和万古霉素对小鼠成骨细胞系MC3T3E1和软骨样细胞系N1511的形态、增殖等的影响，同样发现万古霉素毒性更低，而环丙沙星在最低剂量(25mg/L)造成成骨细胞DNA含量下降。Rathbone等[14]研究了21种抗生素对成骨细胞的作用，发现利福平、二甲胺四环素、强力霉素、萘夫西林、青霉素、环丙沙星、粘杆菌素甲基磺酸和庆大霉素在200mg/L明显降低细胞DNA含量和碱性磷酸酶活性，而阿卡米星、妥布霉素和万古霉素则表现出较小的影响。Parker等[15]研究发现恩诺沙星对骨髓基质干细胞的存活和基因表达影响较大，而青霉素则影响较小。Hoelscher等[16]研究了庆大霉素、万古霉素、头孢唑啉、头孢羟唑对人髓核源椎间盘细胞的存活、增殖和代谢的影响。不同浓度的4种抗生素对椎间盘细胞的存活和增殖均表现为抑制作用，但是对细胞代谢的影响表现比较复杂。每种抗生素至少在一个人来源的椎间盘细胞培养中表现为双向作用，分析数据后发现庆大霉素和万古霉素抑制细胞代谢，头孢唑啉无显著影响，头孢羟唑促进代谢。李萍等[17]在用兔软骨细胞评价喹诺酮类药物的毒性时发现其对细胞增殖和蛋白多糖含量的抑制作用排序依次为环丙沙星、左氧氟沙星、氟罗沙星、帕珠沙星;环丙沙星的抑制作用呈时间和浓度依赖性且随兔年龄的增大而减少。左氧氟沙星对交叉韧带细胞也有细胞毒性，表现为增加细胞凋亡，减少细胞外基质[18]。也有部分抗生素表现出对细胞分化的影响，如盐酸二甲胺四环素、盐酸四环素、盐酸土霉素和强力霉素抑制骨髓细胞向破骨细胞分化，盐酸二甲胺四环素抑制多种在分化中起作用的mRNA上调，但是不影响骨髓细胞和破骨细胞的存活[19]。在体内试验中，四环素和氧四环素也减少了破骨细胞的数量[20]。脂肪干细胞的增殖和软骨分化能力在高浓度庆大霉素(100mg/L)作用下也受到了抑制[21]，而万古霉素在1000mg/L时抑制其增殖，但对其成骨能力影响较小[22]。

然而在抗生素体外缓释的研究中，多种抗生素均未表现出明显的抑制作用[23-25]。部分抗生素对细胞的增殖和代谢并不单纯表现为抑制。低浓度的青霉素、链霉素(最佳浓度100U/mL)可增加人脐带组织源间充质干细胞的增殖，降低凋亡比例，但大剂量使用会降低其细胞外分泌物的基因表达[26]。Gomes等[27]研究发现低剂量(1mg/L)的强力霉素和二甲胺四环素可以刺激成骨诱导培养下人骨髓基质细胞的增殖，维持碱性磷酸酶活性和增加钙磷沉积，而高剂量的抗生素则延缓细胞增殖，妨碍细胞功能。Almazin等[28]研究则发现0.5g/L的强力霉素、二甲胺四环素和洗必泰均抑制人成骨细胞增殖，但是强力霉素可以促进其成熟和分化。Salzmann等[29]研究发现低浓度的头孢呋辛对人成骨细胞增殖无显著影响，而对碱性磷酸酶活性和钙沉积有促进作用，而在较高浓度时，对细胞增殖有显著的促进作用(250，1000mg/L)，但是对碱性磷酸酶活性和钙沉积有明显的抑制作用(1000mg/L)。但是在1000mg/L的头孢呋辛作用72h时，乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)活性显著升高，表现出较强的细胞毒性作用，而且观察作用56d后的钙结节染色照片，1000mg/L组的细胞形态显著异常且稀少。因此，高浓度的头孢呋辛对人成骨细胞的长期作用还需要进一步研究。抗生素作用于局部细胞的机制抗生素对细胞增殖、代谢表现出复杂的影响，原因是多种多样的。Sundin等[30]认为氨基糖甙类抗生素通过损伤细胞膜引起细胞死亡。它们阻碍了磷脂的降解从而影响了细胞膜(脂质双分子层)的完整性。Ehanire等[31]发现妥布霉素作用于MG63细胞后48h出现膜损伤，且与剂量相关。Wiland等[32]认为氨基糖甙类抗生素进入细胞后附着于溶酶体，溶酶体的破裂引起降解酶的释放从而导致细胞死亡。而碱性磷酸酶活性下降也可以通过细胞膜损伤解释，因为碱性磷酸酶是通过磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)附着于细胞膜上[33]。Duewelhenke等[1]认为克林霉素、大环内酯类、氟喹诺酮类、利奈唑酮、氯霉素、利福平和四环素对人成骨细胞的毒性和抑制性是因为其对线粒体能量转换的抑制，而抑制细菌细胞壁合成的抗生素(头孢唑啉除外)和氨基糖甙类抗生素因为缺乏特殊的作用靶点或者缺少受体而不能进入细胞，从而不对人成骨细胞产生作用。具体来说，克林霉素和大环内酯类抗生素可以在细胞内累积，而且大环内酯类可以直接作用于磷脂质，所以作者认为它们可以直接作用于线粒体膜从而影响线粒体能量转化。氟喹诺酮类可能是通过线粒体DNA旋转酶影响线粒体。四环素则可以抑制细菌蛋白合成、真白合成和游离线粒体蛋白合成。利福平抑制真白合成和线粒体RNA合成。氧化损伤也被认为是喹诺酮类药物氧氟沙星致软骨细胞损伤的机制之一[34]。不同类型细胞对抗生素的敏感性不同类型的细胞对抗生素表现出不同的反应。Miclau等[7]比较了不同浓度妥布霉素对MG63和大鼠成骨细胞的作用，发现两者没有明显差别。Duewelhenke等[1]比较了20种抗生素对人成骨细胞、骨肉瘤细胞系MG63和HeLa细胞的影响，发现人成骨细胞更敏感。而且对人成骨细胞，抑制代谢比抑制增殖需要浓度更高的抗生素，而对MG63和HeLa细胞则相反。Antoci等[3]研究表明N1511比MC3T3E1更能耐受环丙沙星对细胞DNA含量的影响，MC3T3E1受妥布霉素的抑制呈浓度依赖关系，而N1511则没有表现出这种关系。而在检测抗生素的细胞毒性方面，MC3T3E1表现出了更高的敏感性，释放了更多的乳酸脱氢酶。相对于人的原代细胞，细胞系细胞在体外倍增时间更短，可能会使抗生素的毒性作用表现更低[3]。而且细胞系细胞高度稳定，并以增殖为主要目的，即使能量短缺，也会首先维持增殖，而原代细胞则可能会首先减少能量消耗而减少增殖，因此在研究各种抗生素对正常人体组织的影响时，细胞系细胞的代表性可能会较差[1]。抗生素长期作用对细胞的影响有效的抗生素治疗通常需要在较长时间内维持局部有效抗生素浓度，既往的研究作用时间通常较短(两三天)，长时间作用细胞会如何反应呢。Gomes等[27]研究了强力霉素和二甲胺四环素对成骨诱导培养下人骨髓基质细胞在35d观察期内的影响。发现这两种抗生素在早期对细胞增殖有剂量依赖的抑制效应，随后则表现为刺激细胞增殖，甚至可使细胞达到2倍以上的增长，在21d后因矿化基质包被，细胞增殖受阻，抗生素剂量越大，抑制期则越长。对碱性磷酸酶活性的影响也表现为早期的抑制和随后的逐渐恢复，但是碱性磷酸酶最高水平低于对照组。在21d后可以观察到钙磷沉积，低浓度抗生素对其有刺激作用，较高浓度在35d也有低密度的钙磷沉积。抗生素作用的逆转抗生素局部应用时，在早期的爆释过后通常会维持在一个相对较低的浓度。早期短时间高浓度的抗生素对细胞的影响在后期较低浓度下或者无抗生素作用下会不会逆转？Salzmann等[29]应用不同浓度的头孢呋辛作用于人成骨细胞24h后，在无头孢呋辛条件下继续培养48h，发现头孢呋辛的作用均可以有不同程度的逆转。Murakami等[35]应用不同浓度的妥布霉素培养鸡胚的胫骨3d后再用无妥布霉素的培养液培养2d，发现糖酵解在2d的恢复期内不仅没有增长，反而表现出了更大的抑制作用，但是蛋白合成和胶原合成在2d表现出了部分恢复，但是仍表现出较大抑制作用。降低抗生素不良作用的方法局部持久的高浓度抗生素释放在治疗严重的骨、关节和软组织感染中至关重要。在维持局部高抗生素浓度的同时如何降低其对局部细胞的不良影响呢？Murakami等[35]研究发现应用妥布霉素珠链时较低的pH值会显著抑制骨代谢，而阻止局部p值降低则会减轻抑制。并进一步研究发现在妥布霉素珠链中加入Ca(OH)2能够调节局部pH值，促进骨代谢和妥布霉素的释放[36]。Glatt等[37]发现成骨条件培养下的人骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶活性和钙沉积被妥布霉素抑制，而这种抑制可以被500μg/L的重组骨形态发生蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2，rhBMP-2)逆转，并且发现妥布霉素并不抑制rhBMP-2的促骨愈合作用，反而增加缺损修复的骨面积。Kawaguchi等[38]同样证实了妥布霉素并不抑制rhBMP-7的促骨愈合作用。碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)对中低浓度庆大霉素所致细胞损伤也有保护作用[39]。甘草黄酮则可以通过降低抗生素引起的线粒体紊乱而减少细胞死亡[40]。

不同抗生素表现毒性不一，作用机制也不尽相同。不同来源的细胞敏感性和代表性也不同。在去除抗生素后一段时间，细胞可表现出不同程度的恢复。采用调整局部pH值或加入骨形成蛋白等也可减轻抗生素对细胞的抑制作用。对于骨科局部应用抗生素对局部细胞影响的研究使我们可以更好的选择合适的抗生素及剂量，更好的治疗骨科局部感染，减少对局部愈合的影响。但是既往的研究多集中于对细胞系的研究，对原代人来源细胞研究较少；对抗生素对细胞作用研究较多，而对随后细胞的恢复研究较少。并且既往的研究多是在设定浓度下的研究，并不能很好模拟正常人体内局部抗生素的动态变化。而且在体外实验条件下，细胞代谢方式以及与周围环境的作用的不同使其并不能很好代表其在体内环境下的表现。因此，抗生素对局部细胞的影响还需进一步研究。