硫酸软骨素生产工艺研究进展

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摘　要：参考近年文献，结合个人实践经验，综述硫酸软骨素生产工艺的研究进展。并对硫酸软骨素的生产工艺进行综合讨论。

关键词：硫酸软骨素；生产；工艺

中图分类号：Q539.7　文献标识码：A　文章编号：1672-979X(2010)11-0381-04

1　几种典型生产工艺及其讨论

1.1　以鲨软骨为原料的一种传统常见工艺

软骨原料1000g，5～8cm，在pH 8.5氢氧化钠溶液5000mL中水解，加氯化钠150g，60℃3h，溶液用6mol／L盐酸调pH 6.0，离心除去固体。上清液用氢氧化钠调pH8.5，加胰来源的酶千分之五水解，53℃3h，65℃酸化溶液至pH6.0终止酶解，室温离心10min除去不溶部分。上清液用2倍体积乙醇沉淀30min。沉积物室温下用乙醇脱水6h。残留乙醇80℃10h除去，得硫酸软骨素钠。

此工艺首先用碱水解，即化学水解，在氯化钠存在下进行，以使硫酸软骨素等糖胺聚糖与其核心蛋白分离，所用碱的浓度不高。溶液调pH6.0，可使部分蛋白质或肽沉淀分离，然后再以酶解进一步除去蛋白质或肽，最后用乙醇沉淀法分离纯化。不过，原料为鲨软骨，用其他动物胰来源的酶则不一定妥当。

此工艺用于生产，基本上可行，但产品纯度可能不高。

1.2　以鲨软骨为原料的无溶剂力化学提取方法

鲨软骨与水80℃处理10min，80℃6h烘干后粉碎成粉末。氢氧化钠与二氧化硅在研磨器中研磨1rain得固体碱试剂。碱试剂与软骨细粉共研磨3min。所得混合物溶于3％氯化钠溶液，调pH6.0，离心。上清液乙醇沉淀得产品。此法所得硫酸软骨素产品收率可从1.1所述传统工艺的8.5％增加到9.3％，纯度可从86％提高到95％。提取时间从3h缩短至3min，能量消耗减少。

上述实验系小规模制备，如工业生产规模则不能充分显现此法的优势。况且碱试剂实际上会有水分，软骨原料也会含水分，所以称为无溶剂提取需要探讨。此实验可给以启发，即强浓碱处理是可行的，可提高收率。此法明显减少氢氧化钠的用量，用较少的碱即可达到高浓度。

1.3　以鱼软骨为原料的一种酶解，活性炭吸附等工艺

鱼软骨45℃水洗涤，碱性条件下加蛋白酶(0.1％，w／v)，55℃3h，95℃5min使酶失活。提取液pH

此方法的成功与否，酶和活性炭的选用和具体操作很重要。在硫酸软骨素的生产中，还可采用硅藻土、高岭土等吸附剂，使用这类吸附剂的过程，溶液的pH值和吸附剂的预处理、用量很重要。而且这些条件都不是固定的，与原料、工艺以及吸附剂的型号甚至批次有关。阳离子交换剂可采用强酸性孔径较大的树脂，吸附效果很重要。如果此工艺的各个纯化过程都很有效，则最后浓缩后喷雾干燥可望得到纯度较高的产品。

1.4　以鲟鱼骨为原料的一种季铵盐纯化等工艺“

鲟软骨和骨洗涤、干燥和粉碎，置于含碱性蛋白酶(5％)的50mmol／L碳酸钠缓冲液中，60℃保温12h，加热使沸10min灭活蛋白酶，过滤并冷却至4℃。滤液加6.1mol／L三氯醋酸溶液使其浓度为5％(v／v)，蛋白质沉淀在4℃离心除去。溶液加乙醇至80％(v／v)沉淀，4℃离心分离。沉淀溶于水，与氯化十六烷基吡啶混合终达1％(w／v)，室温1h，4℃离心收集沉淀。沉淀溶于2.5mol／L氯化钠，乙醇再沉淀(80％，v／v)，4℃离心。最后的沉淀再溶于水，4℃透析(截留相对分子质量M6×103～8×103)2d，冻干得产品。从鲟软骨制得的产品主要含硫酸软骨索A(88.8％)，而从鲟脊柱制得的产品含硫酸软骨素c在60％以上，两者的M分别为8×103和43×103。

此方法几乎使用了所有的纯化方法，而且有过程重复使用，主要目的是为了得到纯品，以进一步开展其表征和生物活性研究。作为实验室制备少量产品可行，但不适于工业化生产。虽然如此，其多种纯化过程可供生产参考。季铵盐法分离糖胺聚糖适于价格较高的产品，如透明质酸。肝素钠目前多采用离子交换法与其他糖胺聚糖等分离。随着肝素钠价格的升高，也可考虑使用季铵盐法。

1.5　以缸鱼软骨为原料的一种超滤纯化工艺

舡软骨破碎后按其干重60kg／m3置于水中，加入一种粗品木瓜蛋白酶，于pH 6.5和65℃水解3h，离心除去不溶物。水解液干重42kg，其中硫酸软骨素13kg，肽19kg，盐相当于氯化物4.5kg。

进行了超滤膜的选择实验，在20℃循环形式运作一定时间，一种孔尺寸为100nm的超滤膜在通透量和对通透物质的选择性方面均占优势。其通透量为90L／h・m3，硫酸软骨素100％保留，肽20％保留，盐50％保留。通过超滤除去肽和盐，可使硫酸软骨素溶液纯度提高30％。溶液的体积浓缩率为3.3。用同一种膜再进行透滤，可使硫酸软骨索溶液中的盐降低55％。

上述实验证明用超滤进行硫酸软骨素溶液的纯化和浓缩是可行的。措施得当可使溶液的体积浓缩率达4。还可进一步采用乙醇沉淀法纯化和浓缩。如此，可使溶剂的消耗和生产成本明显降低。在工业生产规模，如扩大膜的过滤面积可进一步提高脱盐效率。

此方法使用粗品木瓜蛋白酶，提示在工业生产中宜使用酶的粗品以降低生产成本。另外，应根据生产所用原料和工艺的不同，实验设计超滤的设备、操作和在工艺过程中的运用。

1.6　以缸软骨为原料的包括碱性含醇水解纯化工艺

缸软骨在80℃水中加热20min去除肌肉等杂质，用加压水冲洗可得洁净骨。破碎至约10mm，50℃干燥，再粉碎至约0.5衄，冷藏备用。缸胰250g用1.5倍体积含0.2％吐温20的0.1 mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.5)，4-6℃匀浆。缓慢搅拌2h后离心，上液缓缓加入4倍体积冷丙酮(-4℃)，缓慢搅拌30min，过滤收集沉淀，冻干，球磨10s粉碎，得细干粉25.8g，冷藏(-4℃)备用。在磷酸盐缓冲液(0.1mol／L，pH 6.5)中，按100 g／L加入软骨，用商品木瓜蛋白酶或上述酶粉按每1g软骨使用0.75酶单位的酶，在45℃缓慢搅拌进行酶解得水溶液。

木瓜蛋白酶水解条件优化实验结果表明，在pH6.5和65℃时酶解最快，但也使酶失活较快，缓冲液

的浓度为86.6 mmol／L，液相体积与软骨重之比为8.9较好。按以上条件，每1g软骨用酶0.8mg水解2h。结果为：软骨220g(鲜软骨1000g的干重)得水解液1500mL，其中硫酸软骨素23，1g／L，蛋白质(或肽)29.7 g／L，固体残渣60.1g／L，硫酸软骨素收率为15.8％。以蛋白质(或肽)作为杂质计，所得硫酸软骨素的纯度为44％左右。按水解液体积的1.6倍加乙醇，沉淀经洗涤，50℃干燥，再溶于水后，离心除去不溶性蛋白质(或肽)，则硫酸软骨素的纯度可达78％-81％。

重点进行了碱性含醇水解过程的试验设计：一是在反应混合物中氢氧化钠的浓度(0.2-0.6 mol／L)：二是乙醇与水解液的体积比。相应的试验是在4～6℃搅拌下向水解液缓缓加入氢氧化钠含醇水液，使达上述氢氧化钠的一种浓度和乙醇与水解液的一种体积比。3h后离心，所得沉淀溶于水中，并同时以40％醋酸中和。

结果显示，酶粉水解组织中胶原蛋白最慢，但比木瓜蛋白酶彻底，对蛋白聚糖中的蛋白质效果较差。因此，可先用酶粉，再用木瓜蛋白酶纯化硫酸软骨素。为了对比，按上述条件对牛软骨进行了实验，结果证明其效果不如舡软骨。

以不同浓度乙醇和不同醋酸钠含量进行实验，结果显示水解液1.4倍体积的乙醇和乙醇水溶液中含3.8％醋酸钠，可使硫酸软骨素的纯度达97.5％。

碱性含醇水溶液在搅拌条件下可促进水解和蛋白质(或肽)的溶解，同时得到较纯的硫酸软骨素沉淀。在适当的条件下，即氢氧化钠的浓度为0.2mol／L，乙醇与水解液的体积比为1.20℃，1h，则同时进行蛋白质(或肽)的水解和硫酸软骨素的沉淀，从而达到操作简便和经济的目的。最后再经超滤，透析过程，可得99％高纯度的产品。

此方法启示之一是，用原料来源动物本身的胰脏制备粗酶用于生产硫酸软骨素可行，如用于其它动物软骨效果可能较差。建议如用猪软骨作原料，则用猪胰制备粗酶；牛软骨则用牛胰制备。用胰脏制备的粗酶中含多种酶，除多种蛋白酶外，还有淀粉酶和脂肪酶等，有利于水解，且降低成本。微生物发酵生产的碱性蛋白酶也较适合国情。无论用哪种酶，生产中一般宜尽量用粗品。视纯化需要，可选择两种酶分别进行水解，原料中胶原蛋白的含量是选择酶应考虑的一个方面。

碱性含醇水解纯化是一种新的过程，在工业规模上的运用，尚需进一步实验。如措施得当，有望成为一种良好的技术。

2　基于上述生产工艺的综合讨论

结合文献和个人实践，对硫酸软骨素的生产工艺综合讨论于下。

2.1　从组织中提取硫酸软骨素有化学水解法和酶水解法。化学水解法的浓碱工艺，主要缺点是使用大量氢氧化钠和盐酸，不利于环保。目前无论是实验室或工业规模生产均倾向于酶水解法。酶的采用是关键，宜根据原料不同，选用一种或多种酶。酶的特异性宜广，纯度不要求过高。在碱浓度较小情况下采用碱性蛋白酶，可兼有化学水解和酶水解。文献报道的纯酶一般只适合实验室制备用。

2.2　从酶解提取物中分离硫酸软骨素有乙醇沉淀法、季铵盐化合物沉淀法、阴离子交换剂法和阳离子交换剂法。乙醇沉淀法虽为传统方法，在硫酸软骨素的生产中还是很有用的，但宜注意3个问题：　(1)将乙醇加至的溶液体积宜小：　(2)乙醇的用量宜在不同情况下实验确定：　(3)溶液中的盐宣适当选择，醋酸盐的优点是在乙醇水溶液中溶解度较大，不易与硫酸软骨素一并沉淀。季铵盐化合物因试剂消耗成本较高，适于实验室小量制备和工业规模生产中价格高的产品。硫酸软骨素价格较低；工业生产中不宜采用季铵盐，尤其是对于口服产品，纯度要求不够高时不宜使用季铵盐。同样由于硫酸软骨素批产量大，用阴离子交换剂法生产所需交换剂量大。因此，必须选用交换吸附效果好的交换剂，一般说每用1000 kg交换剂至少每批能生产硫酸软骨素100kg，且交换剂机械强度高，耐用，才能有经济效益。文献中报道的离子交换剂大多只适用于实验室小量制备，工业规模生产工艺中以大孔径低交联度的树脂为宜，在本文所引上述有关文献中已部分述及，在我国早年出版的专著和论文中也有较全面类似的介绍。利用阳离子交换剂去除蛋白质(或肽)以提高硫酸软骨素的纯度，目前采用较多。阳离子交换剂的选用也是以大孔径低交联度的树脂为宜。

利用调pH沉淀蛋白质(或肽)也常用。

2.3　以上所述，从酶解提取物中分离硫酸软骨素时。也会同时得到其他糖胺聚糖，故还需进行分级分离。分级分离方法有乙醇分级分离法、丙酮分级分离法，阴离子交换剂分级分离法和凝胶通透层析法。用乙醇分级分离，一般在盐浓度相当于2％氯化钠的条件下，加0.1-2.0倍体积乙醇，在糖胺聚糖中一般情况下硫酸软骨素最后沉淀。用丙酮时也是如此。在工业生产中一般不用丙酮。阴离子交换剂层析，以线性盐梯度洗脱，可使硫酸软骨素与其他糖胺聚糖分离。凝胶通透层析法一般只用于实验室制备硫酸软骨素。

2.4　生产工艺的设计和实施，宜根据产品的要求、用途、生产用原料的来源和质量、生产规模等灵活掌握。例如，原料中如含较大量胶原蛋白，是去除还是回收联产，则方法不同。

2.5　超滤过程的运用，宜根据上述不同情况，严格设计和实施才能成功。国外生物制药工业生产规模的各个过程，均有严格设计，包括超滤在内。无论是酶水解，还是离子交换分离及超滤等过程，要有所创新，取得技术突破才能有良好的经济效益。