D蚕宋二糖对龙胆苦苷口服吸收的影响

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[摘要]该实验研究了D纤维二糖对龙胆苦苷口服吸收的影响。初步考察了不同用量的D纤维二糖在β葡萄糖苷酶或大鼠肠道菌作用下对龙胆苦苷的降解程度，发现D纤维二糖能够抑制龙胆苦苷肠道降解；在口服生物利用度实验中，在高比例条件下（龙胆苦苷D纤维二糖1∶5，1∶10），D纤维二糖能够显著提高龙胆苦苷的口服生物利用度 （P

[关键词]龙胆苦苷；D纤维二糖；β葡萄糖苷酶；口服吸收

[Abstract] In this study， the effect of Dcellobiose on oral bioavailability of gentiopicroside （GPS） was investigate The influence of Dcellobiose on GPS was achieved by calculating the residual GPS after being degraded with βglucosidase or intestinal flora， and the data demonstrated Dcellobiose could inhibit the degradation of GPS in intestines； in bioavailability experiment， Dcellobiose could significantly improve the oral bioavailability （P

[Key words]gentiopicroside； Dcellobiose； βglucosidase； oral absorption

doi：10.4268/cjcmm20161015

龙胆苦苷是印度獐牙菜中环烯醚萜类成分，近期研究表明龙胆苦苷具有降低利血平导致的疼痛[1]、缓解压力引起的胃肠蠕动障碍[2]、缓解实验性急性胰腺炎[3]、防止大鼠关节软骨细胞炎症诱发[4]以及明显的保肝作用[5]。然而，由于龙胆苦苷易被肠道内的β葡萄糖苷酶酶解[67]，导致龙胆苦苷的口服生物利用度较低。王志刚等对龙胆苦苷在肠道内代谢过程进行了详细研究，发现龙胆苦苷进入体内首先会在肠道内被酶解，断裂β葡萄糖苷键被转化为苷元，进而被转化为其他5种代谢物[8]。目前对龙胆苦苷与其体内代谢产物在药理作用及代谢机制方面的研究较多[910，14]，但尚未见通过抑制其体内酶解进而提高生物利用度的报道。由文献报道可知，龙胆苦苷生物利用度低主要是由于龙胆苦苷中β葡萄糖苷键断裂致使龙胆苦苷的降解引起的，β葡萄糖苷酶是人体肠道中或肠道菌群中专一水解β葡萄糖苷键的水解酶。龙胆苦苷是苷元与糖以β葡萄糖苷键连接而成的化合物，D纤维二糖是以同样方式连接的二糖。本研究通过考察不同用量D纤维二糖对龙胆苦苷在β葡萄糖苷酶或大鼠肠道菌作用下的降解程度，初步判断出D纤维二糖对龙胆苦苷的肠道降解具有影响。进一步通过大鼠生物利用度实验，发现D纤维二糖对龙胆苦苷口服生物利用度具有影响。其可能的影响方式见图1。

1材料

龙胆苦苷（四川维克齐生物科技有限公司，批号 140828）；D纤维二糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号 G1403007）；咖啡因 （四川维克齐生物科技有限公司，批号 140711）；β葡萄糖苷酶（夏盛酶生物科技有限公司，批号151012）；脑心浸出液肉汤（BHI，青岛高科园海博生物技术有限公司，批号 HB82975）。

梅特勒1/10万电子天平（MT5 瑞士）；离心机（Legend Micro 21R赛默飞世尔科技）；Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；纯化水装置（MilliQ，美国）；其余试剂为分析级。

2方法和结果

21对照品溶液的制备

精密称取龙胆苦苷3225 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀即得0129 g・L-1 对照品溶液。精密称取咖啡因3250 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀即得0130 g・L-1内标溶液。

22色谱条件

C18 Thermo色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），柱温35 ℃，流动相为乙腈02% 甲酸20∶80[11]，进样体积20 μL，检测波长276 nm，流速10 mL・min-1 。

23样品的制备

231β葡萄糖苷酶水解龙胆苦苷样品制备

称取龙胆苦苷500 mg置于具塞玻璃试管中，加入pH 74的磷酸盐缓冲液100 mL，依次加入质量比为1∶1，1∶5，1∶10 （龙胆苦苷D纤维二糖）的D纤维二糖，37 ℃水浴加热，反应体系中β葡萄糖苷酶活力单位为30 U・mL-1 。加入β葡萄糖苷酶后开始计时，于1，2，4，6，8，10，15，20，30，60 min时间点分别取样，每次取样200 μL置于15 mL EP管中，同时立即加入等体积新配制的缓冲盐溶液，所取样经12 000 r・min-1离心5 min后取上清置于液相小瓶内衬管中，待测。

232大鼠肠道菌群的制备

取大鼠粪便约60 g，加入BHI 120 mL，200 g离心5 min，取上清，上清液5 000×g离心30 min，取沉淀并称重，加入适量BHI复溶即得肠道菌。低温保存备用。

233龙胆苦苷肠道菌群样品制备

称取龙胆苦苷200 mg 3份，并按龙胆苦苷D纤维二糖1∶5，1∶10称取D纤维二糖，吸取232项下肠道菌液150 μL，BHI定容至15 mL，摇匀后立即放入厌氧袋中，分别于10，20，30，40，60 min取样。

24方法学考察

241标准曲线的绘制

分别精密吸取对照品贮存液005，01，05，10，20 mL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀后即得质量浓度分别为0645，129，645，129，258 mg・L-1。以色谱峰面积为纵坐标，以对照品浓度为横坐标进行线性回归，得到线性方程y=10981x+2322，r=0999 9，质量浓度在0645～258 mg・L-1线性关系良好。

242方法学验证

2421精密度精密吸取龙胆苦苷对照品溶液20 μL，重复进样6次，记录峰面积。测得龙胆苦苷峰面积的RSD分别为092%，表明仪器精密度良好。

2422重复性以龙胆苦苷和D纤维二糖两者质量比为1∶10称取并制得混合物，分别按231，233项下方法并加入灭活的酶或菌制得样品各1份，连续进样6次，记录龙胆苦苷峰面积。测得龙胆苦苷峰面积的RSD分别为073%，094%，表明方法重复性良好。

2423加样回收率以龙胆苦苷和D纤维二糖两者质量比为1∶10称取并制得混合物，分别按231，233项下方法并加入灭活的酶或菌制得样品各1份，测其龙胆苦苷的含量。加入上述龙胆苦苷对照品溶液，每份样品进样3次分析并记录峰面积。测得平均回收率分别为9720%，9830%，RSD分别为21%，18%，表明该方法准确度良好。

25D纤维二糖用量对β葡萄糖苷酶水解龙胆苦苷的影响

取231项下样品测得龙胆苦苷含量，D纤维二糖用量对β葡萄糖苷酶水解龙胆苦苷的影响结果见图 2。从图中可以看出，随着D纤维二糖用量的增加，龙胆苦苷的降解率逐渐降低（P

26pH对β葡萄糖苷酶降解龙胆苦苷D纤维二糖的影响

称取龙胆苦苷500 mg置于具塞玻璃试管中，加入pH分别为20，68，74磷酸盐缓冲溶液100 mL，不加D纤维二糖为A组，加入质量比1∶5（龙胆苦苷D纤维二糖）为B组，37 ℃水浴加热，反应体系酶活力单位为30 U・mL-1 。在β葡萄糖苷酶加入后开始计时，于1，2，4，6，8，10，15，20，30，60 min时间点分别取样，每次取200 μL置于15 mL EP管中，同时立即加入等体积新配制的缓冲盐溶液，所取样经12 000 r・min-1离心5 min后取上清置于液相小瓶内衬管中，待测。所有样品平行3份。

3种不同pH条件对龙胆苦苷水解影响结果见图3，结果显示纤维二糖在各pH条件下均能降低龙胆苦苷降解。

27D纤维二糖对龙胆苦苷在肠道菌群中降解的影响

取233项下样品测得龙胆苦苷含量，D纤维二糖用量对肠道菌代谢龙胆苦苷的影响结果见图 4，结果显示随着D纤维二糖用量的增加，龙胆苦苷被降解的程度逐渐降低。原因可能是龙胆苦苷进入体内会被肠道菌群分泌出的β葡萄糖苷酶降解[12]，而当同时加入龙胆苦苷和D纤维二糖，D纤维二糖中14糖苷键可能会竞争性结合β葡萄糖苷酶，D纤维二糖首先被降解，延缓了龙胆苦苷的降解。

28生物利用度实验

281血浆样品的制备

取SD雄性大鼠18只，体重230～250 g，随机分成3组，分别为龙胆苦苷组（100 mg・kg-1）、龙胆苦苷（100 mg・kg-1）D纤维二糖（1∶5）组、龙胆苦苷（100 mg・kg-1）D纤维二糖（1∶10）组，每组6只。实验前禁食12 h，自由饮水，按体重灌胃给药。分别在给药后017，033，067，1，15，2，3，4，6，8，10，12，24 h眼眶取血05 mL，置肝素化的离心管中，4 000 r・min-1离心5 min，分离取血浆，置-20 ℃冰箱中保存。

282血浆样品的处理

取血浆样品100 μL，加入内标溶液10 μL，振荡15 s，加入甲醇500 μL沉淀蛋白，振荡3 min后，14 000 r・min-1离心5 min，取上清，氮气吹干，150 μL乙腈水1∶1复溶，再次离心取上清，按22项下方法测得含量。

龙胆苦苷组与D纤维二糖组药时曲线见图5，不同比例组下的Cmax均高于龙胆苦苷组；生物利用度实验代谢参数见表1，结果显示与龙胆苦苷组比较，D纤维二糖组相对生物利用度分别提高了7213% （1∶5，P

3讨论

文献报道中显示龙胆苦苷的口服绝对生物利用度较低，低于5%[6]，王志刚等通过对龙胆苦苷体内代谢研究发现了其降解机制[8]。杨肖峰等通过对龙胆苦苷在体内外肠道菌群中代谢研究发现了其降解产物主要为龙胆碱和龙胆醛[13]。上述研究均表明龙胆苦苷在肠道内的降解会导致其生物利用度的降低。故本实验采用与龙胆苦苷有相同糖苷键连接结构的D纤维二糖，并考察了不同用量D纤维二糖，不同pH对龙胆苦苷在β葡萄糖苷酶及肠道菌群中降解的影响，得出在相同pH条件下，与未加D纤维二糖组比较，龙胆苦苷的降解量随D纤维二糖用量的增加而减少（P

提高药物口服生物利用度可以通过将药物制备成磷脂复合物[14]，固体分散体[15]，纳米制剂[16]等手段得以实现。但本研究在充分了解药物体内代谢机制的前提下，提出通过抑制代谢过程中的某一环节进而提高其口服生物利用度的设想，进一步选择代谢龙胆苦苷的关键酶β葡萄糖苷酶进行体外酶解实验和大鼠生物利用度实验，所有实验数据都验证了这一设想。该研究为思考提高口服生物利用度的制剂工作者提供了新的思路。

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