优选中药淫羊藿总黄酮含量测定方法
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【摘要】
[目的]比较不同测定方法对中药淫羊藿总黄酮含量测定的影响。[方法]分别采用《中国药典》(2005版)方法(药典法)和《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中2种方法(检验一法和检验二法)测定。 [结果]3批淫羊藿药材中，药典法所测总黄酮含量均值为27.21g/kg，检验一法所测总黄酮含量均值为9.22g/kg，检验二法测得的总黄酮含量均值为8.21g/kg。[结论]采用保健食品检验二法测定淫羊藿总黄酮含量更为简便、合理，可考虑作为淫羊藿中黄酮类物质含量测定的首选方法。
【关键词】 淫羊藿/化学 总黄酮/分析 分光光度法 紫外线
淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(epimedium brevicornum maxim.)、箭叶淫羊藿〔epimedium sagittatum(sieb.et zucc)maxim.〕、柔毛淫羊藿(epimedium pubescens maxim.)、巫山淫羊藿(epimedium wushanense t.s.ying)、或朝鲜淫羊藿(epimedium koreanum nakai)的干燥地上部分。《本草纲目》称其有"益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力"之功效。各种淫羊藿均以淫羊藿苷、淫羊藿次苷及淫羊藿新苷等黄酮类成分为主[1]。现代药理实验研究表明[2],淫羊藿总黄酮能增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有抗衰老、抗肿瘤等功效。
关于总黄酮的测定方法报道较多[3-4]，目前收载入相关国家标准的有3种方法：国家食品药品监督管理局颁布的"保健食品检验与评价技术规范实施手册"收载的2种方法[5](简称"检验一法" 和"检验二法");2005版《中国药典》收录的方法(简称"药典法")[6]。但关于此3法的准确性、合理性比较研究尚未见报道。本试验以淫羊藿为研究对象，以其总黄酮含量为评价指标，比较了上述3种方法对其含量测定的影响，为淫羊藿中总黄酮最佳测定方法的优选提供依据。现报道如下。
1 材料
1.1 仪器 8453e型紫外可见分光光度计(美国 agilent);bp211d电子分析天平(德国sartorius);kq?500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 药材与试剂 淫羊藿药材(样品1批号为080602，样品2批号为080626，样品3批号为080731)购自广州致信药业有限公司，经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定，其原植物为小檗碱科植物淫羊藿(epimedium brevicornum maxim.)的干燥地上部分;淫羊藿苷对照品(批号：110737?200414)、芦丁对照品(批号：100080?200306)均购自中国药品生物制品检定所;聚酰胺粉(柱层析用，60?80目)由浙江台州市路桥四甲生化塑料厂生产;水为双蒸水，甲醇、乙醇、苯、硝酸铝等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1.1 淫羊藿苷对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品，精密称定，加甲醇制成0.1mg/ml的溶液作为储备液，备用。
2.1.2 样品溶液的制备 取本品叶片粉末(过3号筛)约0.2g，精密称取，按文献[6]方法制备供试品溶液，备用。
2.1.3 标准曲线的绘制 取"2.1.1"项下储备液，置10ml量瓶中，加甲醇分别配制成浓度为0.0055、0.0073、0.011、0.0165、0.022mg/ml的溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度，以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为y=52.407x-0.0652(r=0.9996，线性范围0.0055～0.022mg/ml)。
2.1.4 精密度试验 取淫羊藿对照品溶液(0.0165mg/ml)，连续测定5次，结果其吸收度的均值为0.7939，sr为0.02%，表明精密度良好。
2.1.5 重复性试验 精密称取同一供试品0.2g，平行5份，按上述方法测定其含量，结果其含量的均值为25.32g/kg，sr为 0.25%，表明该方法的重复性较好。
2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60min测定其吸收度，结果其吸光度均值为0.1328，sr为0.36%，说明供试品溶液在60min内是稳定的。
2.1.7 加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号：080731，含量27.18g/kg)，加入淫羊藿苷进行试验，结果其平均回收率为101.01%，sr为3.17%，结果见表1。表1 加样回收率试验(药典法)
2.1.8 总黄酮测定 分别取供试品溶液和对照品溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度，计算，结果3批药材中总黄酮含量均值为27.21g/kg。结果见表4。
2.2 检验一法测定淫羊藿中总黄酮含量
2.2.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒质量的芦丁标准品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成0.15mg/ml的芦丁标准溶液。
2.2.2 样品溶液的制备 取本品叶片粉末(过3号筛)1.0g，加入80ml体积分数70%乙醇溶液，按文献[5]方法制备供试品溶液，备用。
2.2.3 标准曲线的绘制 分别精密量取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml,相当于芦丁0、75、150、300、450、600μg,移入10ml刻度比色管中，加入体积分数30%乙醇液至5ml，各加50g/l的亚硝酸钠溶液0.3ml,振摇后放置5min,加入100g/l的硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置6min，加1.0mol/l氢氧化钠溶液2ml,用体积分数30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，在510nm处测定吸光度，以对照品溶液中芦丁的量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为y=1.136x+0.0106(r=0.9991，线性范围0.0782～0.6256mg)。
2.2.4 精密度试验 取对照品溶液(0.03128mg/ml)，连续测定5次，结果其吸收度的均值为0.3705，sr为0.11%，表明精密度良好。
2.2.5 重复性试验 精密称取同一供试品1.0g，平行5份，按上述方法测定其含量，结果其含量均值为9.722g/kg，sr为0.25%，表明该方法的重复性较好。
2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30min测定其吸收度，结果其吸光度均值为0.6766，sr为0.50%，说明供试品溶液在30min内稳定。
2.2.7 加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号:080731，含量9.742g/kg)，加入芦丁进行试验，结果其平均回收率为100.95%，sr为4.17%，结果见表2。表2 加样回收率试验(检验一法)
2.2.8 总黄酮测定 取"2.2.2"项下样品溶液3ml，至10ml容量瓶中，按"2.2.3"项下方法自"各加50g/l亚硝酸钠溶液0.3ml,"起，依法测定吸光度，代入回归方程，计算含量，结果3批药材总黄酮含量均值为9.22g/kg。结果见表4。
2.3 检验二法测定淫羊藿中总黄酮含量
2.3.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒质量的芦丁标准品5.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，即得0.050mg/ml芦丁标准溶液。
2.3.2 样品溶液的制备 取药材1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数95%乙醇25ml，按照文献[5]方法制备供试品溶液，备用。
2.3.3 标准曲线的绘制 吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm处比色。以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为y=0.0273x - 0.0102;r=0.9990。线性范围为0.00495～0.02475mg/ml。
2.3.4 精密度试验 取芦丁对照品溶液(0.0198mg/ml)，连续测定5次，结果其吸光度均值为0.5440，sr为0.04%，表明精密度良好。
2.3.5 重复性试验 精密称取供试品1.0g，平行5份，制备供试品溶液，于波长360nm处测定其吸光值，结果其含量均值为7.796g/kg，sr为 0.53%，表明重现性较好。
2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60min时测定其吸收度，结果其吸光度均值为0.3318，sr为0.19%，说明供试品溶液在60min内是稳定的。
2.3.7 加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号:080731，含量7.742g/kg)，加入芦丁进行试验，结果其平均回收率为102.63%，sr为5.24%，结果见表3。
2.3.8 总黄酮含量测定 分别取3批淫羊藿样品1.0g，精密称定，按"2.3.2"项下制备供试品溶液，于波长360nm处测定吸收值。代入回归方程，计算试样中总黄酮含量。结果3批样品的平均含量为8.21g/kg,结果见表4。表3 加样回收率试验(检验二法)表4 3种方法测定淫羊藿样品中总黄酮含量比较
3 讨论
3.1 测定波长的选择 对"药典法"测定波长的选择，采用淫羊藿苷的甲醇溶液在波长200～800nm之间进行扫描，结果在270nm有最大吸收。同法确定了"检验一法"测定波长在510nm有最大吸收;"检验二法"测定波长在360nm有最大吸收，均与文献[5-6]报道测定波长一致。
3.2 "检验一法"和"检验二法" 样品溶液的制备均采用聚酰胺柱层析纯化总黄酮类化合物，主要因为黄酮类化合物大多具有酚羟基，可被聚酰胺吸附，而与不含酚羟基的成分分离，也能排除叶绿素的干扰[7]。因此，是否加显色剂对其含量测定无显著影响，两法测定结果较接近。
3.3 测定方法的选择 测定结果显示"药典法"测得值显著大于"检验一法"和"检验二法"测得值。主要因为"药典法"测定时无需显色，在270nm有吸收的化合物均可被测定,故结果偏大。 "检验一法"测定须经过nano2?al(no3)3?naoh显色，只有具有邻二酚羟基的黄酮类化合物才能被检测出。但在强碱性条件下进行测定时，许多物质在510nm左右产生吸收[8]，从而可能产生含量偏高的效应。而"检验二法"用聚酰胺柱层析选择性地富集含有酚羟基的黄酮类化合物，不需经显色直接测定，其结果准确、简便，测定方法也更为合理。因此，可考虑作为淫羊藿中黄酮类物质含量测定的首选方法。
【参考文献】
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