PPEs的遗传多样性

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光合自养型真核超微藻(PhotosyntheticPicoeukaryotes，ppes)为粒径小于2μm的自养型真核原生生物［1］，其广泛分布于海洋和淡水生态系统中，作为重要的初级生产者，在水生生态系统的物质循环和能量流动中起着十分重要的作用．尤其在热带、亚热带贫营养海域是重要的初级生产者，对其所在海域的生物量贡献巨大［2］． 1994年Li首次揭示了光合自养型真核超微藻由于具有较大的比表面积和高的碳吸收效率，是海洋初级生产力的重要贡献者［3］．国际上关于真核超微藻遗传多样性的调查和研究多集中于海洋，近几年才有少量关于湖泊的研究报道［4-5］．国内关于真核超微藻遗传多样性的研究才刚刚起步［6］，袁洁等［7］构建了我国南沙海域真核超微藻基因克隆库，发现了大量新型基因序列;王建等［8］对武汉东湖超微藻生态学进行初步研究;陈美军等［9-11］对太湖不同湖区真核微型浮游生物基因多样性进行研究，其中涉及部分微型藻类． 调查真核超微藻多样性，一般将水样经过一定孔径的滤膜抽滤，然后用真核生物18SrRNA基因的通用引物扩增和克隆滤膜上的DNA，最后进行测序和序列比对、生物进化分析［12］．该方法得到的海洋和湖泊样品的克隆库中，三分之二以上的基因序列属于异养真核微生物，但荧光原位杂交方法却发现，在适宜藻类生长的水环境中，通常自养型真核超微藻相对异养真核微生物在数量上占绝对优势［13］．为了更好地揭示光合自养型超微藻的遗传多样性，Fuller等设计了针对真核藻类叶绿体16SrRNA的引物来构建基因克隆库［14］．该引物能够特异性地扩增自养真核藻类，较好地克服传统方法对异样真核微藻较高的扩增率． 本研究采用真核藻类叶绿体16SrRNA的引物来构建基因克隆库，以揭示太湖自养真核超微藻的遗传多样性，从而帮助我们更全面地了解湖泊浮游藻类的群落结构及生态功能，同时为湖泊超微藻的研究和开发利用提供一定的依据． 1材料与方法 1．1藻样采集 梅梁湾位于太湖北部，是目前太湖富营养化程度最高的区域之一，而东太湖的富营养水平在太湖几个湖区中最低［9］．2010年3月采集太湖梅梁湾(T1点)、东太湖(T2点)水样各500ml(图1)．用20μm的滤膜粗滤后分别用2μm、0．2μm的滤膜逐级抽滤，得到粒径范围为0．2～2μm的超微浮游藻类［13］．用10ml离心管收集0．2μm滤膜，加3ml细胞溶解液，－20℃保存． 1．2藻样总DNA提取 将加有细胞溶解液的离心管从－20℃取出，室温溶解．加入350μl10%的SDS，33．5μl10mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃水浴50min后55℃水浴20min，期间每隔10min摇匀，使反应充分．加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，10000转/min、4℃下离心5min．取上清至新离心管中，同样的方法再次抽提．将上清转移至新离心管中，加入等体积异丙醇和0．4倍体积的7．5mol/L的醋酸铵，室温静置10min后，10000转/min、4℃下离心30min．弃溶液，加入1ml的70%乙醇洗涤，10000转/min、4℃下离心15min，弃乙醇．干燥30min，使酒精充分挥发后，每管加入30μl的TE悬浮沉淀，－20℃保存． 1．3PCR反应与产物的纯化 以上提取的藻样总DNA用于目的片段扩增．50μlPCR反应液中含有25mmol/LMgCl2，2．5mmol/LdNTP，10×buffer，5U/μlTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)．采用真核藻类16SrRNA基因的引物对PLA491F:5'GAGGAATAAGCATCGGCTAA3'，OXY1313R:5'CTTCACGTAGGCGAGTTGCAGC3'［14］进行扩增．扩增反应程序:95℃，5min;95℃，1min;55℃，1min;72℃，1min，循环30次，最后72℃，6min．扩增完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取PCR产物目的片段(约822bp)，用Promega公司的PCR纯化试剂盒(Wiz-ard?SVGelandPCRClean-UpSystem)进行纯化． 1．4克隆子筛选 PCR产物经纯化回收后与载体pGEM-TEasy连接，并转化感受态大肠杆菌，涂布于含有Amp、IPTG及X-gal的LB培养平板上，置于37℃培养箱中倒置过夜．在平板上挑取白斑单菌落转移至含有Amp的液体LB培养基中37℃，150转/min振荡培养6～8h．取1μl菌液，用pGEM-TEasy载体的通用引物T7、SP6扩增，电泳检测，对扩增出目的片段的菌液进行测序． 1．5序列分析 将测序获得的序列剪切掉载体和引物区，采用Bellerophon在线软件分析，随后利用核苷酸序列进行分子遗传多样性和分子系统学分析．我们将核苷酸序列相似度为98%的克隆定为属于同一OTU，代表相同的属或种［15］，否则将被认为是不同的藻．本研究共得到14个真核超微藻序列，Cluster软件分析后发现有10个OTU．采用MAFFT5．8软件(align．bmr．kyushu-u．ac．jp/mafft/online/server/)对本研究得到的10个OTU和34个参考序列进行比对，Gblocks软件剪切掉变异较大的区域，Modeltest软件计算得到针对该44个序列构建进化树的最佳参数，最后用PAUP4．0构建NeighbourJoining生物进化树，重复1000次得到Bootstrap值，用MEGA4．1软件对进化树进行编辑． 2结果与分析 2．1DNA的扩增与阳性克隆子筛选结果显示在822bp左右有特异性的扩增片段条带，与预期片段相符(图2)．目的片段纯化后直接与载体pGEM-TEasy连接转化获得数百个克隆，最后每个样品挑出46个阳性克隆进行测序． 2．216SrRNA部分序列分析将得到的序列在NCBI上进行比较分析，发现自养型真核超微藻优势种群为隐藻(Cryptophyta)，占71．4%，其次是硅藻(Bacillariophyta)占14．3%，最后为金藻(Chrysophyta)和定鞭藻(Haptophyta)，分别占7．1%(表1)．构建NeighbourJoining生物进化树(图3)．与国内外研究结果比较，确定了部分藻的具体分类，但大部分为未培养的藻类，无法进行精确定位．分析发现本研究中得到的金藻序列EF052122、定鞭藻序列EF051968及隐藻序列如EF052243、EF052214等均与意大利Naples近海湾藻类亲缘性较近［16］，除金藻相似度为96%，其他藻类的相似度均达到98%～99%．可见湖泊与海洋的藻类组成具有一定的相似性，且隐藻等广泛分布于海洋及淡水湖泊中．硅藻序列EU580495与德国Constance湖及美国Horsetooth水库的硅藻相似度较高［17-18］，说明硅藻在全球分布广泛，且本研究发现的硅藻也多存在于湖泊中．分析发现目前国际上关于超微藻的研究也较少且相对集中，超微藻的已知种类较少．此外在本研究的克隆文库中还发现了一些序列。#p#分页标题#e# 3讨论 3．1方法选择 本研究采用了真核藻类16SrRNA基因的引物对PLA491F、OXY1313R［14］，近年来该引物在海洋真核超微藻研究中得到了广泛应用，弥补了18SrRNA通用引物构建的基因克隆库中大部分属于异养真核微生物而非自养真核藻类的不足，较好地反映了海洋真核超微藻的遗传多样性［19-20］．由于太湖富营养化程度高，细菌含量高，实验中也扩增出部分光合细菌，但目前国际分子生物学数据库中已有大量序列可进行比较，因此可有效排除光合细菌．PCR产物克隆法构建文库是研究超微型真核生物分子多样性的传统方法［21-22］．Zuendorf等对丹麦Mari-ager海峡样品进行克隆文库的构建，对随机选取的400个克隆进行测序，最后获得70个属于不同种类超微型真核生物的OTUs［23］．这些研究均获得了丰富的超微型真核生物多样性，表明克隆文库构建方法适用于本研究，为我们客观认识环境中真核生物多样性提供途径．但构建克隆文库直接测序耗时且花费较大．DGGE是检测微生物多样性的一种快速可靠的方法，其带谱中条带的数量和亮度可相应地反映环境样品中微生物物种的数量和优势种群［24］．此方法的优点是可以同时对大量不同的环境样品比较分析，缺点是不知道样品中具体的生物组成［25］．而构建克隆文库，通过测序及网上比对，能够知道样品中主要的物种组成与相对丰度．结合两种方法，能够扬长避短，即可对不同时空的样品进行分析，也可了解样品的主要物种组成［26］．所以我们将结合这两种方法进一步研究太湖自养真核超微藻的遗传多样性．本研究目前只对太湖2010年3月份T1、T2点的样品进行初次分析，但可以推测湖泊中自养真核超微藻具有复杂的遗传多样性．我们将对太湖这些位点的水样进行进一步调查，系统地研究太湖自养真核超微藻的遗传多样性． 3．2太湖不同湖区自养真核超微藻的分布 T1点位于太湖污染最为严重的梅梁湾，T2点位于水质相对最好的东太湖，本文以这两个富营养化程度相差较大的湖区作为代表来反映太湖不同湖区自养真核超微藻的分布情况．结果表明T1、T2点均有隐藻和硅藻，可见春季隐藻与硅藻分布较为广泛，可能在太湖的其他湖区也存在．其中优势种群为隐藻，说明隐藻适应性强，生长旺盛．金藻多生活在透明度高，有机质含量低的水体中［27］，东太湖金藻的发现，验证了东太湖水质相对较好，能够为金藻的生长提供适宜的环境．已发现的定鞭藻主要存在于海洋中，在淡水生态系统中很少［28］．太湖梅梁湾发现定鞭藻，说明定鞭藻的生境可能比以往认识得更为广泛，还可存在于富营养化的湖泊中．本研究得到的序列经比对后发现很多未培养、系统分类未定的藻类，说明我们对于真核超微藻的研究还很有限，需要进一步加深对其的认识．