红芪多糖对糖尿病大鼠视网膜血小板反应蛋白―1和血小板源性生长因子―B表达的影响
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摘要：目的 ^察红芪多糖（HPS）对糖尿病大鼠视网膜血小板反应蛋白-1（TSP-1）和血小板源性生长因子-B（PDGF-B）表达的影响，探讨其对糖尿病视网膜病变的保护作用及可能机制。方法 采用链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型。雄性Wistar大鼠随机分为模型组、多贝斯组和HPS高、中、低剂量组，另设正常组，每组10只。各给药组给予相应药物灌胃，模型组和正常组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续8周。qRT-PCR和免疫组化检测TSP-1和PDGF-B mRNA和蛋白表达；HE染色镜下观察视网膜的结构。结果 模型组视网膜各层结构清晰、完整，但外核层疏松变薄、排列紊乱，神经节细胞数量稍减少；各给药组较模型组明显好转。与正常组比较，模型组视网膜TSP-1 mRNA和蛋白表达明显降低（P
关键词：糖尿病；视网膜；红芪多糖；血小板反应蛋白-1；血小板源性生长因子-B；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）03-0038-05
Effects of Hedysari Polysaccharide on Expressions of TSP-1 and PDGF-B in Retina of Diabetic Rats ZHANG Hua-zhi1， JIN Zhi-sheng1， LIU Ying1， JIE Rui-ping2， ZHAO Jian-mei1， GAO Yan2 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）
Abstract： Objective To observe the effects of Hedysari Polysaccharide （HPS） on the expressions of TSP-1 and PDGF-B in the retina of diabetic rats； To discuss the protective effect and possible mechanism on diabetic retinopathy. Methods The diabetic model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin. 50 male SPF Wistar rats were randomly divided into 5 groups： model group， calcium dobesilate group， and HPS high-， medium-， and low-dose group， extra 10 rats were set as the normal group， 10 rats in each group. Each administration group was given relevant medicine for gavage， while model group and normal control group were given same amount NS for gavage， once a day for 8 weeks. The mRNA and protein expression of TSP-1 and PDGF-B were detected by qRT-PCR and immunohistochemistry. The retinal structure was observed by HE staining. Results HE staining showed that each layer of the retina of the model group was clear and complete， but the outer nucleus layer became looser， thinner and more disorderly， and the number of ganglion cells decreased slightly； the administration groups were improved markedly compared with the model group. Compared with the normal control group， the mRNA level and protein expression of retina TSP-1 on the model group dramatically dropped （P
基金项目：国家自然科学基金地区基金（81360538）；甘肃省青年科技基金计划（145RJYA297）
administration groups rose （P
Key words： diabetes mellitus； retina； Hedysari Polysaccharide； TSP-1； PDGF-B； rats
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病严重的微血管并发症之一，以视网膜微血管的闭塞及渗出为主要特征，是目前成人首要的致盲原因之一[1]，也是全球中老年人视力下降的主要原因[2]。病理性血管新生是其发生的重要病理改变。相关研究表明，血小板反应蛋白-1（thrombospondin-l，TSP-1）与血小板源性生长因子-B（platelet-derived growth factor-B，PDGF-B）与新生血管的形成密切相关[3-4]，TSP-1被公认为是一种有效的内源性血管生成抑制因子，是第一个被证实可发挥关键作用的天然血管生成抑制剂[5]。PDGF-B广泛存在于发育中的血管，能够促进微血管周细胞生长，保持微血管的正常功能和稳定性[6]，可作为DR早期诊断及病程进展的检测指标[7]。前期研究表明，红芪多糖（Hedysari Polysaccharide，HPS）可通过降低糖尿病大鼠和db/db小鼠视网膜上新生血管内皮生长因子（VEGF）的表达，降低血管通透性，起到保护视网膜的作用[8-9]。
本研究采用qRT-PCR和免疫组化方法观察HPS对糖尿病大鼠视网膜TSP-1、PDGF-B表达的影响，进一步探讨HPS对DR进程中新生血管的生成与增殖的影响及可能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠60只，雌雄各半，8周龄，体质量180～220 g，甘肃中医药大学SPF级实验动物中心，动物许可证号SCXK（甘）2011-0001。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，标准饲料喂养，自由饮水，室温23～25 ℃，湿度50%～70%，实验前适应性喂养1周。
1.2 药物
链脲佐菌素（STZ），Sigma公司；HPS，甘肃中医药大学药学院邵晶副教授进行药物鉴定并提取，纯度为87.44%；羟苯磺酸钙胶囊（多贝斯），西安利君制药有限责任公司，批号14050056。
1.3 主要试剂与仪器
TSP-1鼠抗人多克隆抗体（批号bS-2715R）、兔抗人PDGF-B多克隆抗体（批号bS-0185R），北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色试剂盒（批号K155615B）、兔SP检测试剂盒（批号15155A11），北京中杉金桥生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒Ⅱ（批号R6934-01），OMEGA公司；TranScriptor cDNA第一链合成试剂盒（批号10842320），Roche公司；2×GreenStar PCR MasterMix（批号1418J），BIONEER公司；TSP-1上游引物5'-CTCTGATG GTGATGGCCGAG-3'，下游引物5'- ATGGCGGACAA CCCAGTTAG-3'，产物长度184 bp；PDGF-B上游引物5'-ATGACCCGAGCACATTCTGG-3’，下游引物5'- ACACCTCTGTACGCGTCTTG-3’，产物长度121 bp；以β-actin作为内参照，上游引物5'-GAGGGAAA TCCTGCGTGAC-3'，下游引物5'-GGAGCCAGGC CAGTAATC-3'，产物长度246 bp；One Touch血糖测定仪（美国强生Lifescan公司，型号稳豪倍优），台式高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备，型号CT14RD），掌上离心机（美国SCILOGEX 公司，型号D1008），微量电动组织匀浆器（Tiangen公司，型号OSE-Y10），超微量紫外分析仪（美国Quawell公司，型号Q5000），RT-PCR热循环仪（美国ABI公司，型号7500），冰箱（青岛海尔股份有限公司，型号BCD-29W），光学显微镜（日本OLYMPUS公司，型U-LH100HG）。
2 实验方法
2.1 造模
造模前对大鼠进行全身及眼部检查以排除原发性疾病。随机选取50只大鼠，禁食12 h，30 mg/kg STZ腹腔注射，连续3 d，72 h后尾静脉取血检测血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L者即为糖尿病大鼠模型。造模后1周，复测空腹血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L即为造模成功。另外10只腹腔注入等量柠檬酸钠缓冲液，72 h后测量空腹血糖均
2.2 分组和给药
除正常组10只大鼠外，将造模成功的50只大鼠按随机数字表法分为模型组、多贝斯组和HPS低、中、高剂量组，每组10只。多贝斯组每日给予多贝斯90 mg/kg灌胃，HPS低、中、高剂量组每日给予HPS 50、100、200 mg/kg灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积均为10 mg/mL，每日1次，连续8周。
2.3 指标检测
2.3.1 标本取材 灌胃8周后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，断颈处死，摘取眼球。左眼球去除眼前节，剥离视网膜组织，液氮速冻，置于EP管中，-80 ℃冰箱储存备用，用于qRT-PCR检测；右眼置于4%多聚甲醛（4 ℃，24 h）固定，再固定48 h后切除眼前节，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋，视网膜连续切片。
2.3.2 组织病理学观察 切片脱蜡，乙醇浸泡，苏木精染色，体积分数1%盐酸乙醇分化，体积分数1%稀氨水反蓝，伊红染色，乙醇梯度脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察视网膜组织病理学变化。
2.3.3 免疫组织化学检测血小板反应蛋白-1和血小板源性生长因子-B蛋白表达 按照兔抗人TSP-1、鼠抗人PDGF-B多克隆抗体免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒操作说明对切片进行染色，每个组织块取3 μm厚进行脱蜡，梯度乙醇水化，3%H2O2去离子水孵育，微波（95 ℃，3 min）抗原修复。正常山羊血清封闭，依次加入一抗、生物素化二抗、SP复合物，DAB显色，复染，脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察、拍照。以细胞质内出现淡黄色或深棕色颗粒沉积者为染色阳性反应。各组大鼠随机选取5张切片，每张切片在400倍镜下随机采集阳性染色最强的5个视野，应用Image-Pro-Plus6.0图像分析软件对视网膜TSP-1和PDGF-B的积分光密度（IOD）值进行分析。
2.3.4 qRT-PCR检测血小板反应蛋白-1和血小板源性生长因子-B mRNA表达 按试剂盒说明书提取总RNA，用微量核酸蛋白分析仪计算所得RNA的含量和纯度。取总RNA 3 ?g，按反转录试剂盒说明书进行反转录，以β-actin为内参照进行RT-PCR反应。反应体系：cDNA 1 ?L，上游引物（20 pmol/?L）0.5 ?L，下游引物（20 pmol/?L）0.5 ?L，2×SYBR Green 1 ?L，2×mix 12.5 ?L。加无菌水至25 ?L。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（β-actin 54 ℃、TSP-1 60 ℃，PDGF-B 50 ℃），72 ℃延伸30 s，共40个循环。反应结束后，得到每份样品中TSP-1和PDGF-B进行PCR扩增时达到阈值的Ct值。计算基因的相对表达量：获得实验样品和对照样品的Ct值，将目的基因Ct值用β-actin归一化后，按目的基因/内参基因计算组间目的基因表达量。每个标本重复3孔，取平均值为Ct值，共进行5次实验。
3 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以―x±s表示，治疗前后各组指标比较采用配对t检验，多样本均数间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P
4 结果
4.1 红芪多糖对模型大鼠视网膜组织病理形B的影响
正常组视网膜组织各层结构清晰、完整，排列整齐；模型组视网膜外核层疏松变薄、排列紊乱，神经节细胞数量减少；各给药组较模型组明显好转。结果见图1。
4.2 红芪多糖对模型大鼠视网膜组织血小板反应蛋白-1和血小板源性生长因子-B蛋白表达的影响
TSP-1和PDGF-B免疫阳性反应呈棕色，位于胞质内。正常组大鼠视网膜TSP-1蛋白阳性表达除外丛状层，其余各层表达均比较丰富，PDGF-B蛋白阳性表达主要见于神经节细胞层、内丛状层细胞，内核层有少量表达；模型组大鼠视网膜TSP-1蛋白阳性反应明显减弱，主要见于神经节细胞层、内丛状层及视锥、视杆细胞层，内核层少量表达，PDGF-B蛋白阳性反应明显增强，阳性反应主要见于内界膜层、神经节细胞层、内丛状层、内核层及外核层，外丛状层少量表达；各给药组TSP-1阳性表达较模型组增强，PDGF-B阳性表达较模型组减弱，见图2、图3。与正常组比较，模型组TSP-1蛋白表达明显降低（P
4.3 红芪多糖对模型大鼠视网膜组织血小板反应蛋白-1和血小板源性生长因子-B mRNA表达的影响
与正常组比较，模型组TSP-1 mRNA表达明显降低（P
5 讨论
血-视网膜屏障破坏、新生血管形成是DR主要的病理特征，目前对于新生血管形成机制虽然已有很多实验及临床研究，但至今仍未完全阐明，考虑可能与周细胞、血小板及其他血液成分等因素有关。TSP-l和PDGF-B均由血小板释放，TSP-l是一种非常重要的多肽类内源性血管新生抑制物，能够影响及调控内皮细胞的黏附、运动、增殖，可以使正常内皮细胞对大部分的促血管生成因子不产生血管生成作用，还可诱导内皮细胞凋亡，所以，TSP-l被公认为一种有效的内源性血管生成抑制因子。其在眼部的研究报道相对较少，有可能是视网膜和脉络膜新生血管的一种重要抑制因子。PDGF-B由内皮细胞分泌，与VEGF相似，在视网膜缺氧以及血管功能出现障碍时表达显著增加。有研究发现，PDGF-B可以诱导兔视网膜内皮细胞的迁移和增殖，促使新生血管的形成[10]。
DR属中医学“消渴内障”“视瞻昏渺”“云雾移睛”等范畴。现代中医机大多认为DR为本虚标实、虚实夹杂之证，本虚为气阴两虚、阴阳俱虚，标实为瘀血阻络。红芪为甘肃地道药材，最早记载于《神农本草经》黄芪项下，列为上品，与黄芪同科异属，具有益气活血、养阴散瘀功效。HPS为红芪的提取物，具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等多种生物学作用。前期研究表明，HPS能够调节db/db小鼠肾组织中多种细胞因子的表达、改善肾间质纤维化和保护肾脏组织[11-14]。本实验结果表明，HPS能升高糖尿病大鼠视网膜上TSP-l表达，降低PDGF-B表达，推测HPS可能是通过升高视网膜TSP-l的含量、降低PDGF-B的含量来抑制DR进程中新生血管生成及增殖，从而延缓DR的发展进程，因此，其在预防和治疗DR方面有一定的应用前景。今后将进一步研究TSP-l和PDGF-B信号通路及上下游细胞因子的表达，来系统阐述HPS对糖尿病视网膜微血管病变方面的发病机制。
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（收稿日期：2016-05-08）
（修回日期：2016-05-22；编辑：华强）