表小檗碱体外大鼠肝微粒体孵育代谢产物鉴定及对CYP2D6酶活性的抑制作用

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[摘要]表小檗碱是黄连中一种主要的异喹啉类生物碱，具有多种重要的药理活性。该实验利用体外大鼠肝微粒体孵育体系，采用LC-MS/MS分析鉴定表小檗碱体外大鼠肝微粒体（RLM）共孵育后的Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物，采用cocktail探针药物法，通过同时测定美托洛尔、氨苯砜、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的含量变化，评价不同浓度表小檗碱对大鼠肝微粒体CYP2D6，CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1，CYP2C9亚型活性的影响。结果表明，表小檗碱在大鼠肝脏可发生Ⅰ相和Ⅱ相代谢，从表小檗碱的大鼠体外肝微粒体温孵体系中鉴定出2个Ⅰ相代谢产物和3个Ⅱ相代谢产物；表小檗碱对肝脏cyp2d6酶呈显著抑制作用，半数抑制浓度IC50为35.22 μmol・L-1，而对CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1，CYP2C9酶的活性没有明显的影响，提示表小檗碱可能存在基于CYP2D6酶的药物相互作用。该研究可为合理开发利用表小檗碱提供实验依据。

[关键词]表小檗碱；大鼠；肝微粒体；代谢产物；CYP450酶

细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）是参与体内药物代谢的重要酶系[1]。某一药物对CYP450 酶的抑制或诱导，可能会影响同时给药的其他药物的代谢[2]，被认为是引起药物相互作用的重要因素[3]。因此，研究药物的代谢途径，以及药物对代谢酶的作用，对了解药物相互作用、制定合理的临床用药方案等，具有重要指导意义[4]。表小檗碱是黄连中一种重要的异喹啉类生物碱，其互变异构体分子结构见图1。研究表明表小檗碱具有较强的抗氧化活性[5]，能够抑制醛糖还原酶，降血糖，对抗糖尿病潜在并发，其作用强于小檗碱[6-8]。表小檗碱虽然有重要的药用价值，但迄今有关其体内过程的研究鲜有报道。本实验旨在通过分析表小檗碱肝脏代谢产物探讨其在体内的主要代谢途径，并采用cocktail探针药物法同时测定6种CYP450亚酶底物的含量，评价表小檗碱对大鼠肝微粒体（rat liver microsomes，RLM）CYP450不同亚型活性的影响，为表小檗碱的开发和药物相互作用预测提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum液质联用仪（包括Surveyor AS，Surveyor LC Pump，Surveyor PDA，TSQ Quantum），配有大气压化学离子源（APCI）和电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur数据系统；Agilent高效液相色谱仪HP1100系列（美国Agilent公司）；TGL 20M型高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；VORTEX GENIVS 3漩涡混匀仪（IKA）；DKZ-450B型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司）；MTN-2800D型氮气吹干仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司） 。

1.2 药品及试剂

盐酸表小檗碱（批号must-12111601，纯度>98%）购自成都曼思特生物技术有限公司；美托洛尔、氨苯砜、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、氧化型辅酶Ⅱ二钠（NADPNa2）、 D-葡萄糖-6-磷酸二钠和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶均购于北京拜耳迪生物技术有限公司（Sigma公司分装）；尿苷-5′-二磷酸萄糖醛酸三钠盐（UDPGA）、丙甲菌素、D-糖酸-1，4-内酯均购自BD公司；乙腈为色谱纯（Fisher Company， Inc.美国）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

清洁级Sprague-Dawley （SD） 雄性大鼠，体重（220±20） g，北京维通利华实验动物中心提供，许可证编号SCXK（京）2013-0001。

2 方法

2.1 肝微粒体制备

采用钙盐沉淀法制备大鼠肝微粒体[9]。空白大鼠，麻醉放血处死后，取出肝脏称重。按1∶3加入Tris缓冲液，用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆液。将匀浆液于4 ℃，9 000×g离心20 min，再取上清液与88 mmol・L-1 CaCl2溶液混匀，使终浓度为8 mmol・L-1 CaCl2，冰浴5 min；4 ℃，27 000×g离心20 min，用上述缓冲液洗涤沉淀1次，所得微粒体以0.15 mol・L-1 Tris-0.25 mol・L-1蔗糖缓冲液（pH 7.4）混悬，分装，-80 ℃冷冻保存备用。用考马斯亮蓝法测定肝微粒体蛋白浓度[10]。

2.2 温孵条件及样品处理

2.2.1 表小檗碱肝微粒体Ⅰ相反应体系温孵 肝微粒体孵育体系包含终浓度为1 g・L-1的RLM 和30 mmol・L-1的表小檗碱，和1倍体积的NADPH再生系统（相当于终浓度为0.5 mmol・L-1 NADPNa2，10 mmol・L-1 G-6-P，1U・L-1 G-6-PDH，10 mmol・L-1 MgCl2）和一定量的KCl缓冲液。总体积为200 μL。采用5 mL聚丙烯离心管37 ℃水浴孵育，除NADPH再生系统外，其他组分首先37 ℃预温孵5 min，然后加入NADPH再生系统启动反应，37 ℃水浴振荡有氧孵育40 min后，加入3倍体积的冰冷甲醇终止反应，1万×g，4 ℃离心20 min后取上清进样10 μL，进行LC-MS/MS代谢物分析，每个样本均做3个重复。

2.2.2 表小檗碱肝微粒体Ⅱ相反应体系温孵[11] 将RLM、磷酸钾缓冲液和丙甲菌素冰浴15 min后，加入D-糖酸-1，4-内酯37 ℃温孵5 min，然后加入NADP启动系统和UDGPA系统启动反应。反应总体系为300 μL，其中含有 1 g・L-1 RLM，25 mg・L-1丙甲菌素，5 mmol・L-1 D-糖酸-1，4-内酯，1 mmol・L-1 NADPH和5 mmol・L-1 UDPGA，表小檗碱终浓度为30 mmol・L-1，反应体系中有机溶剂质量分数不超过3%，37 ℃水浴振荡有氧孵育40 min后，加入3倍体积的冰冷甲醇终止反应，1万×g，4 ℃离心20 min后取上清进样10 μL，进行LC-MS/MS分析，每个样本均做3个重复。

2.2.3 探针药物肝微粒体温孵 将各探针药物与RLM于37 ℃水浴中预温孵5 min，加入NADPH发生系统（终浓度含1 mmol・L-1 NADPNa2，20 mmol・L-1 G-6-P，2 U・L-1 G-6-PDH，20 mmol・L-1 MgCl2），用0.15 mol・L-1的KCl缓冲液（pH 7.4）定容使整个温孵体系终体积为0.4 mL（含有美托洛尔20 μmol・L-1、氨苯砜25 μmol・L-1、非那西丁25 μmol・L-1、氯唑沙宗25 μmol・L-1、甲苯磺丁脲25 μmol・L-1）和1 g・L-1蛋白，于37 ℃水浴中均匀振荡40 min。取出体外温孵样品放入冰浴中，按1∶3加入冰冷的甲醇终止反应，同时加入内标物0.06 g・L-1五味子醇甲20 μL，振摇30 s，于4 ℃，1万×g离心20 min。吸取上清夜氮气吹干，甲醇（400 μL）复容，4 ℃，1万×g，离心20 min，取上清进样20 μL，进行HPLC分析，每个样本均做3个重复。

2.3 色谱条件

2.3.1 表小檗碱肝微粒体代谢物LC-MS检测条件 色谱条件Agilent Eclipse XDB-C18 Column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相乙腈-0.1%甲酸溶液（25∶75）。流速1 mL・min-1；紫外检测波长270 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；柱后1∶4分流。

LC-MS/MS条件：ESI离子源，扫描范围m/z 50～700，喷雾电压3 500 V，毛细管温度350 ℃，鞘气（N2）流速10.0 L・h-1。采用自动迸样器迸样，正离子模式检测。

2.3.2 探针药物HPLC检测条件[12] 采用Agilent SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流速1.0 mL・min-1，柱温40 ℃，进样20 μL。流动相A为磷酸氢二胺缓冲盐（pH 3.6），B为乙腈，梯度洗脱0～4 min，32% B；4～25 min，32%～55% B；25～35 min，55%～32% B。检测波长230 nm。

2.4 表小檗碱对各亚酶活性的影响

在孵育体系中，保持美托洛尔的浓度为20 μmol・L-1、氨苯砜的浓度为25 μmol・L-1、非那西丁的浓度为25 μmol・L-1、氯唑沙宗的浓度为25 μmol・L-1、甲苯磺丁脲的浓度为25 μmol・L-1，变化表小檗碱的终浓度至10，20，40，80，160 μmol・L-1。温孵反应分为不加NADPH的对照组、不加表小檗碱的阴性对照组和实验组进行，反应样本数均为6个样本。根据2.2.3项的步骤温孵和处理样品，HPLC测定孵育液中底物剩余浓度，计算代谢消除率（RMCR），考察表小檗碱对各底物代谢的抑制能力，并计算半数抑制浓度IC50。

2.5 数据处理

探针底物相对代谢消除率（RMCR）的计算方式： RMCR=C0-CtC0-Ct=0×100%。C0，温孵体系中探针底物的初始浓度；Ct，实验组探针底物的剩余浓度；Ct=0，阴性对照组探针底物的剩余浓度。

3 结果

3.1 Ⅰ相代谢产物的鉴定

将表小檗碱20 μmol・L-1与RLM和NADPH共温孵后，发现新增2个色谱峰，其保留时间分别为4.49 min（M-1）和5.02 min（M-2），见图2。这2个色谱峰在肝微粒体灭活样品和不加NADPH样品中均没有检测到。M-1（m/z 322）的分子离子分别比原药分子离子（m/z 336）少14 Da，同时，M-1分子离子的主要二级碎片离子为（m/z 307），比M-1的分子离子少15 Da，是M-1脱亚甲基的碎片。因此，M-1是原药脱甲基的产物。M-2（m/z 324）的分子离子比原药分子离子m/z 336少12 Da，其主要碎片离子为（m/z 309），比M-2少15 Da，说明m/z 309是M-2脱甲基的碎片，见表1。由此可推测M-2可能是原药加氢开环后再脱甲基的产物。

3.2 Ⅱ相代谢产物的鉴定

30 μmol・L-1的表小檗碱在大鼠肝微粒体孵育系统中孵育40 min后，生成3个Ⅱ相代谢产物M-3，M-4和M-5，其保留时间见图3。进一步质谱分析发现，M-3（m/z 498）， M-4（m/z 500），M-5（m/z 514）的分子离子及其二级碎片离子分别为m/z 498/322， m/z 500/324， m/z 514/338。由于M-3～M-5的主要二级碎片离子分别与原药的代谢物M-1，M-2以及m/z 338的分子离子一致，因此，它们应是这些代谢物的Ⅱ相轭合物。以M-3（m/z 498）为例，其特征二级碎片为m/z 322，且M-3（m/z 498）较M-1（m/z 322）多176 Da，故M-3是M-1的葡萄糖醛酸轭合物。同理，可推测M-4和M-5分别是M-2和m/z 338的葡萄糖醛酸轭合产物。其代谢途径见图4。

3.3 表小檗碱对CYP450酶活性的影响

通过表小檗碱对各探针底物代谢消除百分率测定及IC50计算结果表明，表小檗碱仅对CYP2D6显示较强的抑制作用（IC50为35.22 μmol・L-1），对其他亚酶的抑制作用均不明显，见图5，表2。

4 讨论

在肝微粒体孵育体系中，通常分别添加NADPH或者UDPGA来单独检测P450酶或者UGT催化的代谢，少有将2种代谢通路同时检测。本实验研究表明，在肝微粒体系统中让P450酶通路和UGT通路同时工作是可行的。当单独添加NADPH催化反应时，生成脱甲基的Ⅰ相代谢产物，当同时添加NADPH和UDPGA催化反应时，既检测到了脱甲基的Ⅰ相代谢物，又检测到了葡萄醛酸结合的Ⅱ相代谢物，说明表小檗碱在肝脏同时发生了Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应。

本研究中只检测到2个Ⅰ相代谢产物M-1和M-2，却检测到3个Ⅱ相代谢产物M-3，M-4，M-5，可能的原因是表小檗碱Ⅰ相代谢生成加氢开环产物m/z 338，但是由于表小檗碱的同位素峰m/z 338的干扰，没有检测到。在Ⅱ相代谢反应中，Ⅰ相代谢反应生成的m/z 338含有羟基进一步与葡糖醛酸结合，生成M-5，其保留时间改变，而表小檗碱的同位素分子m/z 338由于不含有羟基不能发生葡糖醛酸结合反应，其保留时间不变，从而可以检测到M-5。

生物转化是许多药物消除的主要途径，因此当2种或多种药物经同一代谢酶代谢时，或其中一种为另外一种药物代谢酶的抑制剂或激活剂。药物间则可能由于对肝药酶的竞争而发生相互作用[13]。研究证明，90%的药物主要由CYP2D6，CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1，CYP2C9这5种同工酶代谢，因此选择了探针药物（美托洛尔、氨苯砜、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲）来研究CYP系的5种主要代谢酶CYP2D6，CYP3A4，CYP1A2，CYP2E1，CYP2C9的活性，评价了表小檗碱对这5种酶的抑制作用。表小檗碱对大鼠肝微粒体中的CYP2D6酶活性产生较强的抑制作用，其IC50为35.22 μmol・L-1。当表小檗碱或含表小檗碱的药物和其他药物联用时，可以有效预测药物之间的相互作用，有助于评价药物的安全性，从而指导临床合理用药。

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Identification of metabolites of epiberberine in rat liver microsomes and its

inhibiting effects on CYP2D6

YANG Xiao-yan， YE Jing， SUN Gui-xia， XUE Bao-juan， ZHAO Yuan-yuan， MIAO Pei-pei， SU Jin， ZHANG Yu-jie*

（School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Epiberberine， one of the most important isoquinoline alkaloid in Coptidis Rhizoma， possesses extensive pharmacological activities. In this paper， the liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） was used to study phase Ⅰ and phase Ⅱ metabolites. A Thermo HPLC system （including Surveyor AS， Surveyor LC Pump， Surveyor PDA.USA） was used. The cocktail probe drugs method was imposed to determine the content change of metoprolol， dapsone， phenacetin， chlorzoxazone and tolbutamide simultaneously for evaluating the activity of CYP2D6， CYP3A4， CYP1A2， CYP2E1 and CYP2C9 under different concentrations of epiberberine in rat liver microsomes. The result showed that epiberberine may have phaseⅠand phaseⅡmetabolism in the rat liver and two metabolites in phaseⅠand three metabolites in phaseⅡare identified in the temperature incubation system of in vitro liver microsomes. Epiberberine showed significant inhibition on CYP2D6 with IC50 value of 35.22 μmol・L-1， but had no obvious inhibiting effect on the activities of CYP3A4， CYP1A2， CYP2E1 and CYP2C9. The results indicated that epiberberine may be caused drug interactions based on CYP2D6 enzyme. This study aims to provide a reliable experimental basis for its further research and development of epiberberine.

[Key words] epiberberine； rat； liver microsomes； metabolites； CYP450

doi：10.4268/cjcmm20141938