以马兜铃酸为例探讨中药毒性成分限量标准制定方法
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[摘要] 中药安全性问题引起越来越多的关注，中药毒性成分的限量标准制定迫在眉睫。该文分析了中药毒性成分限量标准研究的现状和问题，归纳和评述了相关毒性成分的限量标准研究方法，提出了中药中毒性成分的限量标准理论值计算方法，并以马兜铃酸为例，制定了其在中药材中的限量标准，以期为中药毒性成分的限量标准研究提供有益参考。
[关键词] 马兜铃酸； 限量标准； 中药； 毒性成分
[Abstract] It is urgent to establish the limit standard of toxic components of Chinese herbal medicine， since the safety of traditional Chinese medicine （TCM） has attracted more and more attention.This paper analyzes the present situation and problems in the study of the limit standard of toxic components of Chinese herbal medicine. In addition， the current methods for setting the limit standards of toxic ingredients of TCM are reviewed in this paper， and we also propose a theoretical calculation method for setting the limit standards of toxic ingredients of TCM. Employing aristolochic acid as a case study， we formulate the limit standard of toxic components of Chinese herbal medicine. We believe this paper would provide some useful suggesting for formulating limits standard of toxic components of TCM.
[Key words] aristolochic acid； limit standard； traditional Chinese medicine （TCM）； toxic components
随着全球经济化的加深，中医药正逐步走上国际化，但中药安全性问题也日渐凸显，相关报道屡见不鲜。尤以近些年含吡咯里西啶类生物碱（pyrrolizidinealkaloids， Pas）的中草药所引起的肝小静脉闭塞病（hepatic veno-occlusive disease，HVOD）[1-2]和含有马兜铃酸（aristolochicacids， AA）的中药所引起的马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy， AAN）[3-5]引起人们的普遍关注。随着人们对中药毒性认识的进一步加深，中药毒性成分的限量标准成为热门研究方向。中药毒性成分限量标准是安全用药的保证，是国家进行中药安全质量监管的重要依据，也是制约中药走向现代化、国际化的“瓶颈”之一。中药毒性成分的限量标准制定迫在眉睫。本文以马兜铃酸为例，探讨了中药相关毒性成分限量标准制定方法。
1 中药毒性成分研究现状与问题
中药毒性成分的检测方法和限量标准成为影响中药发展、国际贸易的主要技术“壁垒”之一。我国在中药毒性成分的研究中已经取得了长足的进步，高月等研究团队有关毒性的研究获得了国家科技进步一等奖。但是在毒性成分的限量标准制定方面还存在着一些问题。
1.1 中药毒性研究多集中于毒理学评价等方面，缺乏明确的毒性成分限量标准研究 目前的毒性研究主要涉及于毒性评价、毒性机理、毒性关系、配伍减毒等方面，但是很少有研究学者根据风险评估数据和毒理学评价进行限量标准研究。而且行业缺乏明确的毒性成分限量标准研究方法，导致中药毒性成分限量标准缺乏科学客观的数据。
以马兜铃酸为例，多数学者都集中于研究马兜铃酸的毒效关系、马兜铃酸的肾毒性数据、马兜铃酸致肾损伤的发病机制等方面。很少有研究学者根据这些相关数据进行限量标准研究。研究表明马兜铃酸类成分可以导致严重的肾损伤，最终发展为肾衰竭。有研究报道[6]，雌、雄大鼠口服马兜铃酸（含77.24%的AAⅠ，21.18%的AAⅡ）的半抵滤懒浚LD50）分别为183.9， 203.4 mg ・kg-1；静脉注射分别为74.0， 82.5 mg ・kg-1。雌、雄小鼠口服马兜铃酸的LD50分别为106.1， 55.9 mg ・kg-1；静脉注射分别为70.1， 38.4 mg ・kg-1。大、小鼠接受高剂量AA后，常呈现肾小管严重坏死，淋巴器官萎缩，前胃浅表性溃疡，鳞状上皮增生和过度角化，15 d内死于急性肾衰。另据报道[7]，0.2 mg・kg-1・d-1的马兜铃酸连续给药4周，对Wistar雄性大鼠无明显影响，1.0 mg ・kg-1可引起轻度改变，5.0 mg ・kg-1有明显毒性，25 mg ・kg-1使肾、前胃、膀胱、出现显著的退行性变，个别可导致肾衰而死亡。马兜铃酸的毒性作用还呈明显的剂量依懒性和时间依懒性。郑法雷等[8]用5 mg・kg-1・d-1给大鼠腹腔注射，用药8周前大鼠肾脏无明显损害，24周出现明显的肾脏间质纤维化病理改变。尽管马兜铃酸类成分的毒性研究比较的深入，但是如何建立合理的马兜铃酸限量标准目前未见文献报道。
1.2 同一个毒性成分在不同品种的中药材中限量标准不一致 以马兜铃酸限量标准为例（表1），2015年版《中国药典》[9]规定天仙藤中马兜铃酸Ⅰ的量不得超过0.01%；细辛中马兜铃酸Ⅰ的量不得超过0.001%；马兜铃没有关于马兜铃酸Ⅰ的限量，只是提示本品含有马兜铃酸，可能引起肾脏损害等不良反应，慎用或者禁用。文献[10]报道，马兜铃中马兜铃酸Ⅰ的含量远高于北细辛、华细辛和天仙藤中马兜铃酸Ⅰ的含量，大约高出100倍左右，有些甚至高达180倍之多。而其他一些马兜铃科植物，比如青木香，关木通、广防己，国家没有对其制定限量标准，而是禁止了其药用。中药历来有配伍减毒的理论，但是这仅对复方而言，目前尚没有报道表明单味药材能够单独配伍减毒。那么不同药材中马兜铃酸限量标准不一致，甚至差别到10倍以上的原因是什么？是因为在药材中马兜铃酸含量不同因而导致限量标准不同？还是因为在不同药材中的马兜铃酸毒性作用不同导致限量标准不同？国家禁用了青木香等药材，是因为马兜铃酸含量较高，但是含有多少量的马兜铃酸药材应该被禁用？假设经过培育后的青木香中马兜铃酸含量极度降低，青木香是否可以重新被应用？这些问题，都需要明确的回答。
2 相关领域毒性成分限量标准研究
毒性成分限量标准制定方法是建立毒性成分限量标准的前提。虽然在中药毒性成分研究中缺乏明确的限量标准研究方法，但是在食品安全、环保等领域均有明确的毒性限量标准研究方法，值得中药毒性成分借鉴。
食品安全[11-12]、水质[13]、环境保护[14-15]中有毒有害成分的限量制定是以毒理学数据为基础，结合毒性成分的毒性程度、毒性成分的暴露情况和人类的日常摄入情况等因素，进行分析评估的结果。对于一个具体的有毒有害成分的限量标准的制定，首先要确立毒性成分的无可见有害作用剂量（no observed adverse effect level， NOAEL）、或最低有害作用剂量（lowest observed adverse effect level， LOAEL）[16-17]或基准剂量（benchmark dose， BMD）[18]，然后通过NOAEL，LOAEL或BMD推算一个可以接受或耐受的摄入量（国际上通用的术语为每日允许摄入量（acceptable daily intake， ADI））[19-20]，然后根据这个值，推算毒性成分的限量值。
NOAEL是指在规定的试验条件下，用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒剂量或浓度。NOAEL是毒理学试验能够确定的一个重要参数，在制订化学物质的安全限量时起着重要作用。
LOAEL是指在一定时间内，一种外源化学物按一定方式或途径与机体接触，并使某项灵敏的观察指标开始出现毒性变化或机体开始出现毒性作用的最低剂量。
BMD是依据动物试验剂量-反应关系的结果，用一定的统计学模型求得的受试物引起一定比例动物出现阳性反应剂量的95%可信限区间的下限值。
ADI是国际上通用的术语，已被许多国家和国际组织所使用。ADI一般来源于敏感动物。
长期毒性实验获得的NOAEL，LOAEL或BMD。NOAEL，LOAEL或BMD除以适宜的安全因子即得ADI。通常将安全因子[21-22]设定为10×10，即人和动物的种间差异为10倍，不同人体间的个体差异为10倍。选择安全因子时，除考虑种间差异和种内差异外，还要考虑化合物的毒性程度、暴露方式等因素，对安全因子进行适当的放大或缩小。相对于一般毒性成分比较，具有遗传毒性、致癌性的强毒性成分，安全因子也更大，限量的制定也更为严格。毒性强，具有致癌性、致畸性的物质，可适当增加安全因子至1 000～ 1万。对于同一化学物质，在使用不同种属动物、染毒方法、接触时间和观察指标时，往往会得到不同的NOAEL或LOAEL。因此，在表示这2个毒性参数时应注明具体试验条件。另外，NOAEL或LOAEL不是一成不变的，随着检测手段的进步和更为敏感的观察指标的发现，这个毒性参数也会得以更新。
NOAEL或者LOAEL方法[23-24]，因其结果受实验组数、每组实验动物数、剂量间隔宽窄等因素影响，准确性不高，其合理性受到了广泛质疑。早在1984年，Crump[25]就提出以基准剂量法（BMD）代替传统的NOAEL/LOAEL法。BMD法[26-27]具有对实验剂量的依赖性低、毒理学判定更科学、对样本量的依赖性低，结果更可靠的优点、而广受研究者的推崇和热捧。
这些方法都广泛的应用于食品安全、水质、环境保护的限量标准研究中。Malsch等[28]利用BMD法研究铬经呼吸道接触的毒性，以支气管肺泡灌洗液的乳酸脱氢酶为临界效应指标，建议四价铬颗粒的急性参考剂量（RfD） 为0.34 mg・m-3。何贤松等[29]利用基准剂量法探讨氯蜱硫磷（毒死蜱）的参考剂量，以乙酰胆碱酯酶活性为检测指标，建议将氯蜱硫磷的参考剂量定为3.6 μg・kg-1。2008年，WHO利用BMD法对婴幼儿奶粉中的三聚氰胺进行了评估，提出三聚氰胺的每日耐受摄入量（TDI） 值为0.2 mg・kg-1・bw-1[30]。顾刘金等[31]应用基准剂量法（BMD）和无可见有害作用剂量（NOAEL）法分析除草剂丁津亚慢性毒性阈值并进行比较，结果发现特丁津原药的基准剂量的可信限下限值均小于相应的NOAEL。毛伟峰等[32]在研究高氯酸铵对去卵巢大鼠甲状腺干扰作用的剂量-反应关系时，以大鼠肝脏Ⅰ型5′-碘酶（5′-DI） 活性、血清3′-三碘甲腺原氨酶（T3）、甲状腺素（T4）和促甲状腺激素（TSH）水平等指标，得出高氯酸铵对去卵巢大鼠甲状腺干扰作用的最低有害作用剂量LOAEL为50 mg ・kg-1・bw-1，基准剂量的可信限下限值为15 mg・kg-1・bw-1，为该类物质的风险评估和风险管理提供了科学依据。
3 中药毒性成分限量标准理论值计算
中药毒性成分限量标准研究可以借鉴环保等领域中有毒有害成分限量标准制定方法。环保等领域毒性成分的NOAEL，LOAEL或BMD等值，相当于中药毒性研究中的最大无毒剂量、最小有毒剂量和基于统计的毒性剂量。在药物安全性评价中，当安全窗范围大于10时，通常认为安全性比较好。这与环保等领域采用人的个体差异10倍相一致。环保领域采用人和动物的种间差异为10倍；中药毒性成分限量亦可采用此标准。安全性剂量本身就是一个剂量区间，只是意味着在此区间范围内，安全性具有较好的保障。因而适当的提高限量标准，可以获得更好的安全保障。从这个意义上而言对于中药毒性成分其安全因子设定为10×10是比较合适的。同样在中药毒性成分的限量制定过程中，安全因子100并不是一成不变的，在综合考虑毒性成分的毒性程度、暴露方式、药材用量等因素的情况下，可以对安全因子进行适当的放大或缩小。
中药毒性成分的限量标准可以通过每日允许摄入量计算得到。
L=AWδ/M（1）
式中，L为限量标准理论值（mg・kg-1）；A为每日允许摄入量（mg・kg-1）；W为人体平均体重（kg），一般按60 kg计算；M为中药每日人均可服用的最大剂量（kg）；δ为摄入因子，表示每日由某种中药摄取的毒性成分的量占该毒性成分总摄入量的比例。由于中药毒性成分结构的特殊性，其来源比较单一，很少出现同时服用含有同一毒性成分的两种或者多种中药饮片，摄入因子一般可以设置为1。从提高安全性标准的角度考虑，或者某些毒性成分确实存在同时服用多个来源的情况，可以适当降低摄入因子。对蓄积性毒性成分，A为某段时期内允许摄入总量，M为服用总量。
从公式（1）可以看出，毒性成分的限量标准与中药每日可服用的最大剂量成反比，从《中国药典》中规定的饮片的服用量范围可以看出，多数饮片的服用量相差不是很大，基本都在同一个数量级范围，特别是含毒性成分的饮片的服用量范围非常接近。因而从这种意义上来说，中药毒性成分的限量标准仅取决于毒性成分的本身，与药材本身关系不大。对于中成药而言，如果确实存在配伍减毒的情况，其NOAEL，LOAEL或BMD就会较药材升高，因而其每日允许摄入量就会增加，限量标准理论将低于单味药材。
需要强调的是，毒性成分限量标准与指标成分限量标准的制定方法是不同的。指标成分限量标准是基于药材中指标成分含量情况，经过统计而得，其数值是比较明确的。因而同一个指标成分在不同的药材中，其含量标准可能是不一样的。而毒性成分限量标准主要取决于其毒性数据，在药材服用量相差不大的情况下，同一个毒性成分，在不同的药材中应该具有同样的限量标准。
毒性数据主要来源于风险评估中的毒理学和流行病学等相关数据的结果，具有较大的变化范围。采用不同的方法，可能会得到不同的毒性数据。而且，从安全的角度考虑，一般希望采用较高的限量标准以便得到较好的安全性。所以从动物到人体的剂量换算采用10倍，而不是7倍，或者更小的数据；安全窗或者不同人体间的差异采用10倍，而不是5倍，或者更小；饮片的服用量也采用最高限；累计服用量也采用一个较长的周期。实际上，在可接受的范围内，往往人为的提高毒性成分的限量标准，以期获得更好的安全性。这也是农药残留、重金属、生物毒素等有害残留物限量技术“壁垒”产生的主要原因。
4 马兜铃酸限量标准
马兜铃酸具有蓄积作用和强致癌性，长期小剂量服用或者短期大剂量服用，都有可能导致毒性反应的发生。有报道采用Meta分析[33]研究了马兜铃酸导致终末期肾病的风险，通^基准剂量法进行建模，计算得出的马兜铃酸导致终末期肾病的阈剂量的可信限下限（benchmark dose lower confidence limit，BMDL）为0.42 g（累积量）。基于马兜铃酸的BMDL，可以计算其在饮片中的限量标准。
L=0.42 g10×10 g・d-1×365 d×100%=0.001 15%（2）
因为0.42 g是基于人的剂量计算的BMDL，所以在计算马兜铃酸限量标准时安全因子为10，表示不同人体间的个体差异为10倍。饮片的每日最大服用量设为10 g，主要是基于2015年版《中国药典》中细辛的最大用量为3 g，马兜铃的最大用量为9 g，天仙藤的最大用量为6 g。马兜铃酸为蓄积毒性，而且文献[34]表明马兜铃酸所导致的肾毒性多数由长期服药导致的，平均用药时间中位数为5年。由于近年来加大了对含马兜铃酸药物的用药时间控制，降低了相关药物长期服药时间，但是为了具有较好的安全性，经综合考虑设定累计服用周期为1年。这主要是基于马兜铃酸强致癌性，且代谢非常缓慢，而且在肾脏中呈蓄积性，需要叠加不同的服用时间。该处设置的摄入因子为1，即认为从一种途径或者一种中药饮片中摄入马兜铃酸。
从公式（2）的计算结果可以看出，2015年版《中国药典》中细辛中马兜铃酸的限量标准比较合适，而天仙藤的限量标准有些偏低，马兜铃没有限量标准是不合适的。而且，关木通等药材的禁用也不是特别合适。只要毒性成分能够满足上述标准，药材就应该可以使用；如果达不到，自然不可使用。
5 结语
中药毒性是中药研究中不可忽视的重要内容，毒性成分限量标准研究应该获得广泛的关注。通过借鉴环保等领域毒性成分限量标准建立方法，本文建立了中药毒性成分限量标准研究方法，并得到了马兜铃酸Ⅰ的限量标准。中药中毒性成分限量标准的制定，首先应根据中药毒性成分的毒理学评价结果，确立毒性成分的NOAEL，LOAEL或者BMD，结合适宜的安全因子，推导并确定每日允许摄入量，然后根据限量标准理论值计算公式，最终确定中药中毒性成分的限量标准。中药毒性成分的限量，与毒性成分本身、药材服用量有关。对大多数中药材而言，由于服用量基本一致，都在同等数量级别内，因而可以建立一致的毒性成分限量标准。需要强调的是毒性成分限量标准与指标成分限量标准的制定方法完全不同。本文的研究建立了科学、合理的中药毒性成分限量标准制定方法，为毒性成分国家标准的建立提供了思路，为中药的安全应用提供了可靠的依据。
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