油菜花粉总脂肪酸部位的提取与纯化工艺研究
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[摘要]对油菜花粉总脂肪酸部位的提取（CO2超临界萃取）和纯化（醇洗除杂）工艺进行优化。通过星点设计-响应面法，以脂肪油的得率为指标，对油菜花粉总脂肪酸部位的CO2超临界萃取工艺进行了优化；通过正交设计，以总脂肪酸（亚麻酸酰胺、亚麻酸甘油酯、亚麻酸和棕榈酸）含量为指标，对提取物进行醇洗除杂。优化得到超临界萃取工艺为萃取温度60℃，萃取压力35MPa，萃取时间3h，纯化工艺为醇浓度80%，醇倍量为50倍，醇提时间1.5h。油菜花粉总脂肪酸部位经提取纯化，质量分数能达到60%左右，且该工艺稳定可行，适于工业生产。
[关键词]超临界萃取；油菜花粉；总脂肪酸；星点设计；响应面法
油菜Brassica campestris L为十字花科芸苔属植物。油菜花粉由蜜蜂采集的油菜花粉加入蜜蜂的唾液和蜂蜜组成。油菜花粉中脂肪类化合物的含量丰富，杨艺婷对20种蜂花粉中脂肪酸的组成进行了分析，其中油菜花粉脂肪酸可达5.30mg・g-1，且饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比例合理，具有很高的开发利用价值和可观的经济前景。CO2超临界萃取和醇洗除杂相结合工艺得到的油菜花粉总脂肪酸部位，经药效实验证明，具有良好的抗前列腺增生的作用，现对具体工艺条件进行优化。
1 材料
KCC高精度计数天平（上海恒平科学仪器有限公司），JJ-1大功率电动搅拌器（常州国华电器有限公司），索特真空干燥箱（南京索特干燥设备厂），HAl21-50-02型超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司），BC-R501旋转蒸发器（上海贝凯生物化工设备有限公司），DZF-6020真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），Mettler AL204电子天平[1/1万，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，Agilent 1100高效液相色谱仪（配DAD四元泵，Alhech3300蒸发光散射检测器），Millipore纯水仪（Ellr 5，上海密理博贸易有限公司）。
油菜花粉（产地：内蒙古集宁；鉴定人：康济大药房中药执业药师吴舟），乙醇（徐州香醅酒业有限公司，食用级），甲醇（南京化学试剂有限公司，批号10112511291），乙腈（TEDIA，批号12125004），亚麻酸（百灵威科技有限公司，批号00224ME），亚麻酸甘油酯（百灵威科技有限公司，批号20509），棕榈酸（中国食品药品检定研究院，批号190029201001），亚麻酸酰胺（上海医药工业研究院）。
2 方法及结果
2.1 总脂肪酸含量测定方法
2.1.1 色谱条件
色谱柱为YMC J'sphere ODS-H80（4.6mm×250mm，4μm），流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～10min，40%～60%A；10～20min，60%～80%A；20～30min，80%～100%A；30～35min，100%A），流速1.00mL・min-1，ELSD漂移管温度85℃，气体空气，流速3.0L・min-1，柱温35℃，进样量20μL。
2.1.2 对照品溶液的制备
分别精密称取亚麻酸酰胺对照品0.05634g，亚麻酸甘油酯对照品0.01000g，亚麻酸对照品0.18520g，棕榈酸对照品0.10307g，依次置于25，10，10，25mL量瓶中，加甲醇使溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得2.2536g・L-1对照品储备液①，1g・L-1对照品储备液⑦，18.52g・L-1对照品储备液③，4.1228g・L-1对照品储备液④。
分别精密吸取对照品储备液①2mL，②3mL，③1mL，④2mL置于同一10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液Ⅰ，再精密吸取混合对照品溶液Ⅰ1mL置于2mL量瓶中，再用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液Ⅱ。混合对照品溶液Ⅰ中的质量浓度依次为0.4507，0.3000，1.852，0.8246g・L-1。混合对照品溶液Ⅱ中的质量浓度依次为0.2254，0.1500，0.9260，0.4123g・L-1。
2.1.3 供试品溶液的制备
称取一定量的油菜花粉工艺样品，精密称定，置25mL量瓶中，用甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。
2.2 前处理
取油菜花粉适量，加6倍量水常温搅拌4.0h，滤干或离心，除去上清液，沉淀减压干燥，得油菜花粉水洗部位。
2.3 超临界萃取工艺优化
将油菜花粉水洗部位粉碎成粗粉，称取一定量，置萃取釜中加热加压循环提取，提取完成后从出料口出料，得提取物，称重，计算得率（按油菜花粉水洗部位计算）。
2.3.1 单因素实验设计
考察萃取压力、萃取温度、萃取时间和装料量对得率的影响，以脂肪油得率作为考察指标。
2.3.1.1 装料量对得率的影响 控制CO2流量1.5L・min-1，萃取温度40℃，萃取时间2h，萃取压力40MPa，考察装料量为600，800，1000，1200，1400g对萃取得率的影响，见图1。随着装料量的增加，萃取得率降低。主要原因可能是装料量较大时，流体受阻，易形成沟流、返混，流体与固体颗粒不能充分接触，影响传质，因此不宜装料太多，在保证萃取得率的情况下，采用最大装量1000g。
2.3.1.2 萃取压力对得率的影响 控制CO2流量1.5L・min-1，装料量1000g，萃取温度40℃，萃取时间2h，萃取压力分别为20，25，30，35，40MPa进行超临界萃取，见图2。压力从20MPa上升至35MPa时，萃取得率迅速增加，从10.25%增加到13.49%，压力继续增加，得率增加不明显。考虑到高压状态下，操作的危险性和成本，后续考察时压力设为35MPa。
2.4.1 纯化方式的考察
进行纯化工艺研究时，首先考虑使用大孔树脂纯化，但由于该超临界萃取物温度较低时呈固态，冬季上柱时萃取物会凝固在柱子里导致堵塞，需加热后才能继续洗脱，夏季此现象不太明显，并且得率较低，说明此工艺受温度影响较大，超临界萃取物（脂肪油类）不适合进行树脂纯化，后考虑采用醇洗除杂的方式进行纯化，基本的工艺路线为：采用一定浓度，一定倍量的乙醇进行搅拌，静置，滤过，滤渣弃去，上清液减压浓缩至干为油状物，即得总脂肪部位。
2.4.2 纯化工艺的考察
该纯化工艺采用正交设计，控制温度为50℃（萃取物呈液态，且总脂肪含量均较高），对乙醇浓度，溶剂倍量，搅拌时间3个因素进行考察，见表6。具体实验方案与结果见表7，8。
2.4.3 纯化结果分析
由表7对正交结果进行直观分析，极差大小顺序为RA>RB>RC，既影响因素顺序为乙醇浓度>乙醇倍量>搅拌时间；从表8方差分析结果可知，乙醇浓度对总脂肪酸含量影响极显著（P
2.4.4 纯化工艺验证
根据正交设计优选的纯化工艺对油菜花粉超临界萃取物纯化工艺进行3批验证。取油菜花粉萃取物，加入50倍量80%乙醇，50℃搅拌1.5h，静置，滤过，滤渣弃去，上清液减压浓缩至干为油状物，进行总脂肪酸含量测定，并计算得率，见表9。
由表7，9可知，A2B2C2工艺验证得到的结果（63.78%）与正交中A2B2C3的结果（63.23%）基本一致，说明搅拌2，1.5h，效果相当，进行该水平的修订是稳定可行的。
3批纯化工艺验证的纯化得率较稳定，且总脂肪的含量在63%左右，说明该纯化工艺能够得到总脂肪酸部位，且工艺稳定，可重复。
3 讨论
油菜花粉总脂肪部位作为一种非极性和弱极性成分，通常的提取采用弱极性的有机溶剂，但成本较高，且易存在溶剂残留的现象。超临界流体萃取技术是近20年发展起来的一项新型分离精制技术，具有工艺简单、操作方便、操作温度低、溶解能力强、无毒、无污染、无溶剂残留及产品易分离等优点，对某些中药中的非极性和弱极性的某些类有效成分的提取具有优越性，适用于油菜花粉脂肪酸部位的提取。
大孔吸附树脂是近30年发展起来的一种有机高聚物吸附剂，是吸附性和筛选性相结合的多孔性高分子材料，近年来，大孔吸附树脂技术被广泛应用于中药成分的分离纯化。但其有机溶剂残留物的安全问题存在诸多争论，且由于脂肪油类受温度影响较大，冬季不易上柱，导致工艺不稳定。较之复杂而不稳定的大孔树脂纯化工艺，本实验采用乙醇洗涤除去水溶性杂质的方法，得到50%以上的总脂肪酸部位，该方法简便而迅速，且无有机溶剂残留，适用于工业生产。
正交实验设计是最常用的实验设计方法，广泛用于各种工艺的优化。它是从实验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行实验的，通过对这部分实验结果的分析了解全面实验的情况，迅速找出最优的水平组合，具有实验次数少，数据分析方便等优点，该油菜花粉总脂肪酸部位的纯化工艺就采用了正交实验设计，快速得到了总脂肪部位，并对工艺进行了优化。
星点设计―效应面法作为一种新型的实验设计方法，采用非线性数学模型进行拟合，复相关系数较高，在中心点进行重复性实验以提高实验精度，预测值更接近真实值，星点设计模型拟合的优度可用方差分析进行判别，根据模型可采用解方程求极值或限定效应范围求解因素水平区间的办法获得较佳工艺条件。通过绘制效应面可以直接读取较佳工艺条件，简便而直观。CO2超临界萃取工艺的优化直接影响到后期的纯化，因此，本实验采用更加严密的星点设计―效应面法优化了萃取工艺，保证顺利纯化得到总脂肪酸部位。
本研究通过星点设计―效应面法优化得到超临界萃取工艺为萃取温度60℃，萃取压力35MPa，萃取时间3h，通过正交设计优化得到纯化工艺为醇浓度80%，醇倍量为50倍，醇提时间1.5h。经提取纯化得到的总脂肪部位在60%左右，工艺稳定，可用于大规模生产，并且经药效实验证明，该部位具有良好的抗前列腺增生的作用，可结合油菜花粉其余有效部位，开发成抗前列腺增生的药物。