替米沙坦片的人体药动学和生物等效性

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作者：黄鹏，张红，徐文炜，李艳艳，熊玉卿

【关键词】 替米沙坦；色谱法,高压液相；生物等效性

Pharmacokinetics and bioequivalence of telmisartan in Chinese healthy volunteers

【Abstract】 AIM: To develop a HPLC method with fluorescent detection to determine telmisartan in human plasma and study the pharmacokinetics profiles and bioequivalence of telmisartan in healthy Chinese volunteers. METHODS: In a randomized two period crossover study, 24 healthy male volunteers received single dose of 40 mg telmisartan. The serum concentration of telmisartan was determined by HPLC method. The pharmacokinetic parameters of the two preparations (test and reference) and the relative bioavailability after oral administration were calculated with statistic analysis. The column was Diamonsil C18 (5 μm, 4.6 mm×150 mm). The mobile phase consisted of acetonitrilepotassium dihydrogen phosphate buffer solution (61∶39, pH adjusted to 3.74 with H3PO4) at a flow rate of 1.0 mL/min. The internal standard was candesartan. The fluorescence detector was operated at λEx=305 nm and λEm=365 nm. RESULTS: The calibration curve of telmisartan was linear in the range of 0.5-144 ng/mL (r=0.9998). The absolute recovery was 79.62%-85.69% (n=5), and the relative recovery was 101.92%-108.95% (n=5), and the intraday and interday RSDs were 4.23%-9.80% and 4.03%-9.95% (n=5). AUC0~96 of the test and reference preparations was 888.90±406.49 and 895.03±364.53, respectively. CONCLUSION: Statistical analysis showed that the two preparations were bioequivalent.

【Keywords】 telmisartan; chromatography, high pressure liquid; bioequivalent

【摘要】 目的： 建立测定替米沙坦血浆浓度的高效液相荧光检测法（HPLC），考察替米沙坦的药代动力学及生物等效性. 方法： 24例健康受试者单剂量交叉口服40 mg替米沙坦片供试制剂或参比制剂后，用HPLC测定替米沙坦血药浓度并计算药动学及相对生物利用度，进而对主要药动学参数进行统计分析. 色谱柱为Diamonsil C18柱（5 μm, 4.6 mm×150 mm），以乙腈磷酸二氢钾缓冲液（61∶39，磷酸调pH=3.74）为流动相，流速1.0 mL/min，坎地沙坦为内标，荧光检测波长λEx=305 nm, λEm=365 nm. 结果： 测定替米沙坦的线性范围为0.5～144 ng/mL, r=0.9998，绝对回收率在79.62%～85.69%（n=5），相对回收率在101.92%～108.95%（n=5），日内和日间RSD分别为4.23%～9.80%和4.03%～9.95%（n=5）. 供试制剂与参比制剂的AUC0~96分别为888.90±406.49和895.03±364.53. 结论： 两种替米沙坦制剂均具有生物等效性.

【关键词】 替米沙坦；色谱法，高压液相；生物等效性

0引言

替米沙坦（telmisartan）是新一代的血管紧张素Ⅱ受体拮抗药，其作用机制为选择性阻断血管紧张素Ⅱ与AT1受体结合而产生降压作用［1］. 有研究表明，替米沙坦对AT1受体具有高度的选择性，对其他心血管系统的受体无影响，呈现良好的抗高血压作用，单独用于治疗中度高血压可使50%以上的患者得到有效控制；尤其适用于对其他降压药不能耐受或过敏的各型高血压患者［2］. 本研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC），探讨替米沙坦片在人体内的药代动力学过程，并对其生物等效性进行评价，为正确应用替米沙坦提供理论参数和实验依据.

1材料和方法

1.1材料替米沙坦片（商品名为美卡素）： 40 mg/片，批号： 107567，德国勃林格殷格翰国际公司产品；替米沙坦片： 40 mg/片，批号： 021218，替米沙坦对照品（含量99.62%）及内标坎地沙坦对照品（含量92.0%）均为济南隆格医药科技有限公司产品；SHIMADZU高效液相色谱仪（LC10AD溶剂泵，RF10AxL荧光检测器），HW2000色谱工作站，SUPELCO固相萃取仪，Bond Elut固相萃取小柱（C18, 100 mg, 1 mL）日本岛津公司； 色谱柱：Diamonsil C18柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm）迪马公司；流动相： 0.01 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（称取1.36 g磷酸二氢钾溶于双蒸水至1000 mL，用磷酸调pH=3.74）乙腈（39∶61）；流速： 1.0 mL/min；荧光检测波长： λEx=305 nm, λEm=365 nm. 24名健康男性志愿受试者均为江西医学院在校学生，年龄19～23岁，体质量55～65 kg，身高164～173 cm，试验前接受全面体检，其血、尿常规、肝、肾功能、心率、血压、心电图等均为正常.

1.2方法

1.2.1血样处理首先往固相萃取小柱中加入甲醇2 mL浸润活化抽干，再加入重蒸水2 mL使小柱填料平衡. 取血浆样品0.5 mL置于1.5 mL离心管中，加入内标液10 μL，旋涡震荡混匀成血浆样品，上柱，然后用0.05 mol/L磷酸二氢钾（称取1.36 g磷酸二氢钾溶于双蒸水至200 mL，用磷酸调pH为4.6）和甲醇的混合物（4∶1）0.25 mL冲洗2次，洗液弃之，再加入0.4 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，进样20 μL， 按上述色谱条件测定.

1.2.2标准曲线制备精密称取适量的替米沙坦标准品与坎地沙坦对照品，用流动相溶解，并用正常人血浆稀释，配制成含标准品0.5, 2.0, 6.0, 18.0, 36.0, 72.0和144.0 μg/L的系列血样，其中内标坎地沙坦浓度为1.0 μg/L，分别按血样处理方法处理后进样.

1.2.3精密度和回收率精密配制含替米沙坦2, 18和72 μg/L的系列对照品血浆1.0 mL，各浓度均为5份，按前法测定日内、日间变异和方法回收率.

1.2.4健康志愿者的选择与试验方案受试者试验前2 wk未服用过其他药物，试验期间忌烟、忌酒. 本试验采用随机交叉单剂量双周期试验方案，将24名健康男性志愿者按体质量配对后随机分为2组，禁食12 h后分别口服供试制剂或参比制剂40 mg，分别于服药前（0 h）及服药后0.3, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0, 12.0, 24.0, 48.0, 72.0, 96.0 h采集上肢静脉血3.5 mL至肝素化试管中，3000 r/min离心10 min，分离出血浆置-20℃冷冻保存，10 d内测定. 24名受试者服药2 wk后，交叉给药重复上述试验.

统计学处理： Cmax, Tmax用实测值表示，AUC0-t用梯形法计算，AUC0-∞=AUC0-t+Ct/λZ，Ct为最后一点的血药浓度，λZ为末端消除速度常数，可用对数血药浓度时间曲线末端直线部分斜率求得，t1/2可按t1/2=0.693/λZ求出. 用3P97软件对梯形法计算的AUC0-t及实测的Cmax取对数后进行方差分析及双单侧t检验，以考察其生物等效性.

2结果

2.1血药浓度测定方法的评价

2.1.1方法的专属性在该色谱条件下测得的色谱图中可见血浆中替米沙坦保留时间为5.2 min，内标的保留时间为3.7 min，替米沙坦峰、内标峰与血浆杂质峰完全分离，无内源性杂峰干扰，具有较高的专属性（图1）.

A： 空白血浆；B： 血浆+替米沙坦+内标；C： 口服40 mg替米沙坦2 h后的血样.K： 坎地沙坦；t： 替米沙坦.

图1人血浆替米沙坦高效液相色谱图（略）

2.1.2线性范围血浆中替米沙坦经线性回归得标准曲线： Y=0.0779X0.0057(r=0.9993)，结果表明，血浆中替米沙坦浓度在0.5~144 μg/L范围内与峰面积比线性关系良好. 最低定量下限为0.5 μg/L（S/N=3∶1）.

2.1.3回收率和精密度试验按“1.2.1”的方法处理血样，记录样品与内标峰面积，将样品峰面积/内标峰面积代入到标准品的回归方程，得到相应的浓度，从而求得血浆中替米沙坦方法回收率，取上述各浓度血样日内分别测定5次，连续测定5 d，得日内及日间精密度（表1）.

2.2血药浓度测定健康志愿者口服40 mg替米沙坦片的平均药时曲线如图2.

表1人血浆中替米沙坦浓度的回收率（略）

RSD： 相对标准误差.

图2健康志愿者单剂量口服替米沙坦的平均药时曲线（略）

2.3主要药动学参数采用3P97软件计算健康志愿者单剂量口服替米沙坦片，所得的主要药代动力学参数见表2.

表2健康志愿者单剂量口服替米沙坦的主要药代动力学参数（略）

2.4生物等效性评价和相对生物利用度将两制剂的主要药动学参数对数转换后进行方差分析及双单侧t检验，结果表明两制剂具有生物等效性，其相对生物利用度为(106.13±6.62)%.

3讨论

目前国外报道的测定人血浆替米沙坦方法有放免［3］和高效液相色谱法［4］，国内仅有液质联用的检测报道［5］. 本试验通过改进色谱条件，调整流动相pH值及比例，建立了测定血浆中替米沙坦浓度的高效液相色谱荧光检测法. 已有文献报道替米沙坦生物样品预处理方法［1-4］一般为多次液液萃取，操作过程不仅烦琐，步骤甚多，而且回收率低，不利于大样本的生物分析. 本试验选取C18小柱固相萃取方法，比较了甲醇、乙腈等多种溶剂对样品杂质的洗脱情况，发现血浆样品经一定比例的甲醇和缓冲液洗脱，既除去血浆杂质的干扰，又保证替米沙坦和内标的高回收率，所得的色谱图分离完全，无测定干扰，具有操作简捷，重现性好的优点. 为此，可以认为本试验建立的HPLC方法是替米沙坦的体内药物分析的良好方法，特别对与大样本生物分析时，既能节省时间又能节省试验经费，为今后生物等效性分析或生物利用度研究提供了一种简单、经济、确实可行的方法.

【参考文献】

［1］ Stangier J, Su CA, Hendriks MG, et al. The effect of telmisartan on the steadystate pharmacokinetics of digoxin in healthy male volunteers［J］. J Clin Pharmacol, 2000,40(12):1373-1377.

［2］ Stangier J, Schmid J, Turck D, et al. Absorption, metabolism, and excretion of intravenously and orally administered ［14C］ telmisartan in healthy volunteers［J］. J Clin Pharmacol, 2000,40(12):1312-1315.

［3］ Stangier J, Su CA, Roth W. Pharmacokinetics of orally and intravenously administered telmisartan in healthy young and elderly volunteers and in hypertensive patients［J］. J Int Med Res, 2000,28(4):149-152.

［4］ Monton M, Jimenez A, Nunez A, et al. Comparative effects of angiotensin Ⅱ AT1type receptor antagonists in vitro on human platelet activation［J］. J Cardiovasc Pharmacol, 2000,35(6):906-911.

［5］ 赵志刚，高晨，欧阳冬生，等. 替米沙坦片人体生物等效性［J］. 中国临床药理学杂志，2003,19(5):348.