体外血小板流动腔研究方法的建立和应用
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【摘要】目的 建立模拟体内血液流动环境下，实时观察、研究血小板与血管表面血管性假性血友病因子（vwf）相互作用的模型。方法 利用包被vwf的细玻璃管模拟血管，分别采用负压装置、蠕动泵和恒流注射泵产生不同流态和精确剪切率的流体环境，结合倒置显微镜和电荷耦合器件图像传感器（ccd，charge?coupled device）实时观察和记录血小板或细胞在流体作用下的一系列反应。结果 血小板和转染了血小板糖蛋白ib?ⅸ的中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary，cho），在不同流态下都可与玻璃管壁上的vwf相互作用，从而介导血小板或cho细胞与玻璃管壁的瞬时结合（滚动），并最终牢固结合在玻璃管壁上。结论 本研究方法可以在精确剪切率和不同流态的流体环境条件下，实时地观察、记录血小板与vwf相互作用的情况，为血小板各种生理功能的研究以及相关药物的研究应用创造条件。 【关键词】 流动腔； 血小板； 血小板糖蛋白ib?ⅸ（gp ib?ⅸ）； 血管性假性血友病因子
the development and application of a flow chamber for platelet research
cheng hong，yuan yan?hong，fan yu?bo，li de?yu，dai kei?sheng
（department of bioengineering，beihang university，beijing，100083，china）
abstract： objective to establish an in vitro model for observing the real?time interaction between platelets and vascular vessel.methods thin glass tubes coated with von willebrand faeter ( vwf) were used to form the flow chambers.siphonage system，peristaltic pump and a constant flow syringe pump were adopted to supply different kinds of flow and well defined shear rates.with inverted microscope and charge?coupled device （ccd），a series of reactions of platelets and chinese hamster ovary（cho） cells transfected with glycoprotein ib?ⅸ under flow conditions were recorded simultaneously.results platelets and cho cells transfected with glycoprotein ib?ⅸ rolled and steadily adhered on the tube wall through binding to vwf under different kinds of flow and well defined shear rates.conclusion this flow chamber allows real?time observation and record of the interaction between platelets and vwf under well?defined shear rate.this approach can be applied to platelet adhesion research.
key words： flow chamber； platelet； glycoprotein ib?ⅸ（gp ib?ⅸ）； von willebrand factor
血小板表面膜糖蛋白（glycoprotein，gp）ibα与受损血管内皮表面血管性假性血友病因子（von willebrand factor，vwf）的结合是血小板血栓形成的起始步骤。这一结合使得血小板与血管内皮表面发生瞬时的结合，并以滚动的方式黏着于血管内皮表面，与此同时，启动血小板内一系列的细胞信号传导途径，发生ca2+浓度增加，pi3k活化等反应[1]，使得血小板表面整合素αⅱbβ3活化[2]。αⅱbβ3与vwf和血浆中纤维蛋白原结合，最终使得血小板牢固附着于血管表面，并相互聚集成团，形成血栓。可见，gp ibα与vwf的结合在血小板血栓形成中起着起始、关键的作用。这一过程的研究对预防和治疗血栓形成性疾病有着重要价值。
血小板和vwf的相互作用通常的研究方法有：使用血小板聚集仪检测瑞斯托霉素（ristocetin）诱导的血小板聚集；流式细胞仪技术或elisa直接检测血小板和vwf的结合等。但这些方法很难反映体内血管流动条件下血小板与血管内皮的直接相互作用的实时情况。在本研究中，我们将vwf包被于细玻璃管表面以模拟血管受损的情况，同时分别使用负压装置、蠕动泵和恒定注射泵以产生不同流态和精确剪切率的流体环境，成功地建立了体外流体条件下血小板与vwf相互作用的流体模型，为血小板相关的基础研究，以及抗血小板相关的抗血栓药物研究，提供了一种切实有效的研究方法。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器
1.1.1 实验材料 转染gpib?ⅸ的中国仓鼠卵巢细胞（cho）[3]，vwf（本实验室自备），新鲜健康人全血。
1.1.2 仪器 倒置显微镜（ix71，olympus），color uideo camera （tk?c1381，jvc），照相软件（mpeg?ⅱ capture player），负压水柱的控制系统（st?2s两轴信号控制器，上海亿奥信息光学科技有限公司），蠕动泵（7550?30，北京中科科尔仪器有限公司），注射泵（wzb?50，长沙维科特科技有限公司），玻璃细管（gc120?7.5，内径0.69 mm，外径1.2 mm，长7.5 cm，harvard apparatus inc.）。
1.2 实验方法
1.2.1 vwf的包被 用0.1m的nahco3（ph 8.3）把vwf稀释到30 μg/ml，注入玻璃管，置于湿盒中4℃孵育过夜。pbs冲洗玻璃管3次。pbs液配制5%的牛血清白蛋白室温下封闭2 h。pbs冲洗玻璃管3次。
1.2.2 血小板悬液制备 取健康献血者新鲜的静脉血，加入1/7的acd（2.5%柠檬酸三钠，2.0%d?葡萄糖，1.5%柠檬酸）抗凝。300 r/min离心10 min取上清得到血小板富集血清（prp）。prp，1 500 r/min，离心15 min。cgs（0.12 m nacl，0.0129m柠檬酸三钠，0.03m d?葡萄糖，0.1%牛血清白蛋，ph 6.5）洗2次，modified tyrode’s buffer（2.5 mm hepese，150 mm nacl，2.5 mm kcl，12 mm nahco3，5.5 mm d?葡萄糖，1 mm cacl2，1 mm mgcl2，1mg/ml bsa，ph 7.4）重悬浮血小板。37℃下静置1～2 h使血小板重新恢复到静息状态。
1.2.3 转染gpib?ⅸ的cho 表达gpib?ⅸ的cho细胞生长至100%盖满培养瓶，取出75%重植在新培养瓶生长过夜。消化下cho细胞，modified tyrod’s buffer重悬浮细胞。室温下静置1/2 h。
1.3 流动腔实验 把包被了vwf的玻璃管装在倒置显微镜上，分别使用负压装置、蠕动泵、恒定注射泵3种动力系统，根据公式r=4qπr3精确计算玻璃管中的剪切率[4]，使得血小板或cho细胞悬液通过玻璃管。流动起始后，显微录像系统显示并记录玻璃管中的情况。最后用modified tyrode’s buffer在同样剪切率调节下冲洗玻璃管5 min，仍然黏附的细胞即为激活了整合素αⅱbβ3的稳定黏附。
2 结 果
血小板血栓的形成与血管中的血流情况密切相关[5]。病理性剪切力能诱导血小板的黏附、聚集[6]。有研究者采用平板流动腔和锥板黏度计来模拟体内血液流动。我们采用细玻璃管简单而直观的观察到流动条件下血小板与vwf结合的全过程（示意图见图1）。gpⅰbα与vwf的相互作用使得血小板在vwf表面以滚动的方式发生瞬时的黏附，同时启动血小板内一系列细胞信号转导途径，最终激活整合素αⅱbβ3导致血小板发生稳定的黏附。
图1 实验系统示意图
把包被了vwf的玻璃管装在倒置显微镜上，通过硅胶管连接到提供动力装置，样品分别在负压装置、蠕动泵、恒定注射泵的带动下流经玻璃管，在流出口收集样品。同时通过ccd系统将图像传输到计算机，同步显示并录像。
2.1 负压系统 利用虹吸原理，根据液面差的不同，可提供相对较恒定流态的流体环境。但限于装置本身的特点，往往只能提供较低剪切率的流体环境，本研究中使用的流体剪切率为315.817s?1。
2.1.1 血小板 将血小板悬液流经包被有vwf的玻璃管，可见不断有血小板以滚动方式黏附到玻璃管表面，这是gpⅰbα与vwf的相互作用所介导的血小板在玻璃管表面的瞬时结合。其中大部分滚动的血小板经过一段时间后便不再滚动，牢固地结合在玻璃管表面，表明αⅱbβ3已被激活。也有一小部分血小板在短暂的停留即瞬时黏着后，又开始滚动，然后被冲走。见图2。
2.1.2 cho细胞 由于血小板是无核细胞碎片，无法对其进行基因调控以及蛋白表达变化情况进行研究。为克服这一缺陷，我们将gpⅰbα、gpib和gpⅸ 基因导入cho细胞，建立了能表达完整的gp ib?ⅸ的cho细胞。为研究表达gp ib?ⅸ的cho细胞在该系统中的作用与血小板有无差别，我们将cho细胞悬液流经玻璃管，也同样观察到和血小板一样的黏附现象。说明该系统也同样适合于对表达gp ib?ⅸ复合物的细胞与vwf的相互作用情况进行研究。见图3。a．剪切率1034.166s?1，血小板浓度1.32×107/ml。由于浓度降低，血小板黏附的数目明显减少。
b．剪切率1034.166s?1，细胞浓度1.6×105/ml。由于细胞没有吹散，有连在一起的2个细胞一起发生黏附。黏附的细胞数比低剪切率情况下多，说明高剪切力有利用gpib与vwf的结合。
2.2 蠕动泵 蠕动泵产生流量近似为正弦式的脉动流，更类似于血液流动的情况，而且，蠕动泵的动力系统可机械调控，能提供一个相对较高的剪切力环境，因此，我们选择蠕动泵对作为动力来源，对血小板在该流态下与玻璃管表面vwf的结合情况进行了研究。本研究中使用的流体剪切率为1034.166s?1，相当于41.4 dynes/cm2，略高于正常人动脉中的剪切力范围20～30 dynes/cm2。有研究显示[7]，随着剪切力从低变高，gp ib?ⅸ介导的血小板黏附增多。为进一步验证这一结论，我们分别对在本条件下，对血小板和cho细胞与vwf相互作用情况进行研究，并与2.1中的结果进行比较。
2.2.1 血小板 我们把血小板的浓度稀释1倍，血小板流经玻璃管壁与vwf相互接触的几率就变小，因此发生稳定黏附的血小板数目必然减少。血小板悬液经蠕动泵产生的剪切率为1034.166s?1的流态通过vwf包被的玻璃管后，仍然有一定数量血小板发生了稳定黏附。见图4
图4 在注射泵提供的流态下血小板和表达gpib?ⅸ的cho细胞在vwf表面的黏附情况
a．剪切率250s?1，血小板浓度3×108/ml。正常生理浓度情况下，大量的血小板与vwf结合。
b．剪切率250s?1，细胞浓度1.0×106/ml。传代多次后，gpib的表达量降低，黏附的细胞数减少。细胞黏附的数目与细胞膜表面gpib的表达量正相关。
2.2.2 cho细胞 我们把与2.1中相同浓度表达gp ib?ⅸ复合物的cho细胞，在蠕动泵较高的剪切力作用下通过vwf包被的玻璃管，可见，与低剪切力（负压装置）条件相比，有更多的细胞稳定黏附到玻璃管壁上。
结果表明，在蠕动泵产生的脉动流态下，可以观察到血小板膜蛋白gp ib?ⅸ和vwf的相互作用；在相对较高剪切力条件下，gpib?ⅸ介导的血小板在vwf表面的黏附增多。
2.3 注射泵 注射泵可以提供一个比较宽的剪切率范围（2?17 000 s?1），虽然其流态仍然是脉动流，但相对于蠕动泵要平稳的多，因此，我们用注射泵作为动力来源，对血小板在该流态下与玻璃管表面vwf的结合情况进行了研究。选择剪切率为250s?1。
2.3.1 血小板 正常生理浓度的血小板（300×108/l）悬液流经vwf包被的玻璃管时，视野中有大量的血小板黏着到玻璃管的表面。稳定黏附的血小板的数目与血小板悬液的浓度是正相关的。
2.3.2 cho细胞 表达gpib?ⅸ的cho细胞（1.0×106/ml），流经vwf包被的玻璃管时黏附到玻璃管的表面。但由于经传代多次后，gpib的表达量有所降低，因此黏附的细胞数明显减少，进一步表明细胞黏附的数目与细胞膜表面gpib的表达量正相关。
3 讨 论
血小板发挥止血功能和产生血栓需要血小板黏着到内皮下基质，而这一过程是由血小板膜糖蛋白ibα与vwf相互作用所起始的。gpⅰbα与vwf的结合诱导一系列的细胞内信号传导使得黏附的血小板被激活：ca2+浓度的改变，蛋白激酶c、pi3k、蛋白磷酸化酶和酪氨酸激酶等的活化，并发生血小板肌动蛋白的重新排列[8]，活化整合素αiibβ3介导更稳定的黏附，致密颗粒释放出内容物诱导血小板聚集。gpⅰbα与vwf的结合是血小板发挥其功能的关键步骤。
目前体外研究血小板功能的方法主要可分为2类：一类是在静止的条件下，例如流式细胞术，elisa，免疫荧光染色，聚集仪。但是以上的这些方法都不能反应流动状态下血小板发生的黏附、聚集反应；另一类是采用平板流动腔和锥板黏度计研究剪切力对血小板的功能的作用[9]。平板流动腔结合显微镜、录像系统主要被应用于观察、检测流动状态下血小板的黏附反应，锥板黏度计主要应用于研究剪切诱导的血小板聚集（shear?induced platelet aggregation，sipa）。这两种装置可以记录下流动条件下血小板黏附、聚集的全过程。
我们所建立的方法可观察和记录特定剪切率条件下，血小板或转染细胞发生黏附的过程。与通常使用的平行平板流动腔和锥板黏度计相比，我们的方法有以下几个优点：（1） 装配简单，剪切力不会因为装配的误差而产生影响。平行平板流动腔提供的剪切力与上下平板间距离的平方成反比，装配时的误差会对计算剪切力带来较大的影响。而锥板黏度计的锥尖由于长期使用会产生磨损，改变了锥体与平板间原有的角度，这样所产生的剪切力将不再是一致的。我们的方法不存在装配误差对剪切力的影响。（2） 样品使用量小，节约了样本。（3） 便于观察。由于玻璃管是透明的，我们在光学显微镜下就能清楚地观察到血小板悬液流动和黏附的情况。我们的系统也可以对血小板或细胞进行荧光染色观察。而目前还没有商品化的可视化的锥板黏度计，需要实验室自己加工。（4） 表面处理简单。当我们研究剪切力对血小板直接作用的机制时，必须消除血小板表面同实验系统间的相互作用。使用锥板黏度计时通常采用硅油或其它非血栓形成材料表面来消除这些相互作用。而使用玻璃管只需要采用bsa封闭就可以达到要求，操作简单又方便。
我们的方法也存在一些缺点。当负压系统提供动力时，是由于虹吸原理把细胞悬液吸入到玻璃管中，可在此过程中，水柱的液面高度差逐渐缩小，使得流速缓慢地发生改变。蠕动泵是在流动腔技术中广泛采用的，但是产生的是正弦流动，这与我们希望的稳定恒流不同。注射泵流速稳定，但不能建立循环的流动系统，由于血小板黏附反应时间较短，所以使用注射泵完全能够满足要求。本系统除了可以研究血小板和vwf的相互作用外，还可以用于研究血小板各种黏附因子与其受体的相互作用。本方法高效易行，能广泛应用于体外血小板的功能研究，在揭示止血和血栓的形成机制，以及诊断血栓疾病等方面有重要的应用前景。
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