人参茎叶总皂苷脂质体与水溶液在大鼠体内的血药浓度及药代动力学参数对比分析

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[摘要] 该试验探讨人参茎叶皂苷脂质体与水溶液在大鼠体内的血药浓度及药代动力学参数对比差异。通过大鼠静脉注射人参茎叶总皂苷水溶液和脂质体后，用高效液相色谱法检测血浆不同时间点的9种主要人参皂苷单体Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd的血药浓度，通过3p97软件拟合数据。大鼠静脉给药后，血浆中可测得9种目标皂苷。水溶液的达峰时间一般在0.05～0.083 3 h；脂质体的达峰时间一般在0.5 h之后。经软件拟合后，人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rg2，Rc，Rd，Rb3的水溶液均为二室模型，脂质体为一室模型；人参皂苷Rb1的水溶液和脂质体为三室模型；Rb2的水溶液为三室模型，脂质体为一室模型。9种皂苷脂质体的药-时曲线下面积（AUC）均大于水溶液的曲线下面积，而且脂质体在体内停留时间较长，清除率较水溶液的清除率慢，半衰期一般也较水溶液长。研究结果显示通过静脉注射给药方式，对2种剂型的药动学参数进行对比，人参茎叶总皂苷脂质体与水溶液在大鼠体内的药动学显著不同，脂质体使药物在体内的浓度维持较长时间，降低了药物体内消除速度，提高药物疗效。人参茎叶总皂苷脂质体与传统剂型相比，提高了药物的缓释长效，为今后研发人参皂苷新剂型起到了重要意义。

[关键词] 人参茎叶总皂苷； 药代动力学； 脂质体； 水溶液； 静脉注射

[Abstract] The experiment was aimed to investigate the difference of plasma concentration and pharmacokinetic parameters between liposome and aqueous solution of toatal ginsenoside of ginseng stems and leaves in rats， such as ginsenosides Rg1， Re， Rf， Rb1， Rg2， Rc， Rb2， Rb3， Rd. After intravenous injection of liposome and aqueous solution in rats， the blood was taken from the femoral vein to detect the plasma concentration of the above 9 ginsenoside monomers in different time points by using HPLC. The concentration-time curve was obtained and 3p97 pharmacokinetic software was used to get the pharmacokinetic parameters. After the intravenous injection of ginsenosides to rats， nine ginsenosides were detected in plasma. In general， among these ginsenosides， the peak time of the aqueous solution was between 0.05 to 0.083 3 h， and the serum concentration peak of liposome usually appeared after 0.5 h. After software fitting， the aqueous solution of ginsenoside monomers Rg1， Re， Rf， Rg2， Rc， Rd， Rb3 was two-compartment model， and the liposomes were one-compartment model； aqueous solution and liposome of ginsenoside monomers Rb1 were three-compartment model； aqueous solution of ginsenoside monomers Rb2 was three-compartment model， and its liposome was one-compartment model. Area under the drug time curve （AUC） of these 9 kinds of saponin liposomes was larger than that of aqueous solution， and the retention time of the liposomes was longer than that of the aqueous solution； the removal rate was slower than that of the aqueous solution， and the half-life was longer than that of the water solution. The results from the experiment showed that by intravenous administration， the pharmacokinetic parameters of two formulations were significantly different from each other； the liposomes could not only remain the drug for a longer time in vivo， but also reduce the elimination rate and increase the treatment efficacy. As compared with the traditional dosage forms， the total ginsenoside of ginseng stems and leaves can improve the sustained release of the drug， which is of great significance for the research and development of new dosage forms of ginsenosides in the future.

[Key words] toatal ginsenoside of ginseng stems and leaves； pharmacokinetic； liposome； solution； intravenous injection

人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A，Mey.的干燥根[1]，是我国传统的名贵中药。人参茎叶总皂苷（total ginsenoside of ginseng stems and leaves，GSLS）为五加科植物人参P. ginseng A. Mey.的干燥茎叶经加工制成的总皂苷。人参茎叶总皂苷中主要有效成分为人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd等单体皂苷。人参茎叶所含人参皂苷的药理作用与人参根中皂苷基本相同[2]。研究表明人参皂苷具有多种药理活性，如保护心肌细胞、抗心肌缺血、保护中枢神经系统、增强记忆力、提高免疫力、抗癌、抗肿瘤、抗氧化和抗衰老[3-9]等作用。但是，人参皂苷对生物膜的渗透性差，口服生物利用度仅为1%～20%[10]。而改变剂型是一种有效改善人参皂苷生物利用度的方法。

脂质体（liposome）系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体[11]。主要成分为磷脂和胆固醇。脂质体具有组织相容性、细胞亲和性、靶向性、缓释性、提高药物稳定性、降低药物毒性和改变给药途径等作用[12-15]。目前研究通过制备人参皂苷脂质体从而提高其生物利用度，降低体内的消除速度，提高疗效[16]。

本文选取人参茎叶总皂苷为研究对象，考察其脂质体和水溶液静脉给药后在大鼠体内的血药浓度和药代动力学性质的差异。

1 材料

CXTH-3000高效液相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司）；KQ-250B型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ABS 320-4N型分析天平（上海岛韩实业有限公司）；电热恒温水浴锅（北京国华医疗器械厂）；Avanti TM J-3OI冷冻高速离心机（美国BECKMAN）；JHD-001氮吹仪（极恒实业有限公司）；2XZ-4型旋片式真空泵（上海恒科学仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海美普_仪器有限公司）。

人参茎叶总皂苷以及人参皂苷单体Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd均购自吉林大学化学公共化学教学与研究中心（总皂苷含量≥80%，单体皂苷纯度均≥98%）；淫羊藿苷（上海源叶生物有限公司，纯度98%）；大豆卵磷脂（上海太伟药业有限公司）；胆固醇（上海生物化学试剂公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

雄性SD大鼠，体重180～220 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号SCXK（吉）2011-0004。

2 方法

2.1 人参茎叶总皂苷脂质体的制备[17]

采用逆相蒸发法[18]制备人参茎叶总皂苷脂质体。将人参茎叶总皂苷、磷脂和胆固醇用无水乙醇溶解于茄形瓶中，置水浴60～70 ℃溶解，于旋转蒸发仪上40 ℃蒸发，形成薄膜。将PBS溶液（pH=7）置于45 ℃水浴中，保温，待用。再加入乙醚和PBS水相使薄膜溶解，置于旋转蒸发仪上使乙醚挥尽。即得人参茎叶总皂苷脂质体混悬液。

2.2 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱，0～24 min，18.5%～21.5%A，24～26 min，21.5%A，26～30 min，21.5%～29%A，30～52 min，29%～30.5%A，52～55 min，30.5%～36.5%A，55～60 min，36.5%～38%A，流速1.0 mL・min-1；检测波长203 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL；内标物淫羊藿苷。

2.3 溶液的制备

人参皂苷对照品溶液制备：分别精密称取9种单体人参皂苷置于量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度为0.2 g・L-1的溶液。

内标溶液的配制：精密称取淫羊藿苷置于量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成0.02 g・L-1的内标溶液。

2.4 血浆样品处理

取100 μL血浆置于Eppendof管中，加入淫羊藿苷内标溶液50 μL，涡旋混匀30 s，加入400 μL纯甲醇，涡旋混匀3 min， 13 000 r・min-1离心10 min，吸取上清液，重复3次，置于氮气流中吹干，用甲醇：乙腈（2∶1）100 μL溶解，13 000 r・min-1离心取上清，10 μL进样分析。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 取空白血浆100 μL，按2.4项血浆样品处理方法处理，按照2.2 项色谱条件进样，得到大鼠血浆空白液相谱图。将一定浓度的对照品溶液和内标混合加入到大鼠空白血浆中，同法得液相色谱图。取含药血浆药品依法操作，得液相色谱图。

2.5.2 线性关系考察 取大鼠空白血浆100 μL，加入不同量的混合对照品溶液，质量浓度分别为0.2，2，10，40，100，160，200 mg・L-1。按2.4项血浆样品处理方法处理，按照2.2项色谱条件进样，记录各对照品和内标的峰面积，以对照品质量浓度（X）与对照品和内标峰面积比值（Y）作线性回归。以信噪比S/N>10的最低质量浓度作为定量限。

2.5.3 精密度与准确度试验 取空白血浆100 μL，加入混合对照品溶液，质量浓度分别为2，40，160 mg・L-1，按2.4项血浆样品处理方法处理，制备血清样品各5份。于1 d内测定，根据标准曲线计算浓度，计算所得数据的相对标准偏差（RSD）即为批内精密度；此后，在1个月内任意4 d，每天分别测定上述3种浓度的样品液3份，计算所得数据的RSD即为批间精密度。

2.5.4 回收率试验 取空白血浆100 μL，加入一定量的混合标准品溶液，配制成质量浓度分别为2，40，160 mg・L-1的血清样品各3份，按2.4项血浆样品处理方法处理，按血样标准曲线计算浓度，除以理论浓度，即为方法回收率。

2.6 含药血浆的制备

将12只SD健康大鼠随机分成人参茎叶总皂苷脂质体组和水溶液组，每组6只，按大鼠体重计算给药量，12只大鼠隔夜禁食后，经大鼠股静脉注射给药50 mg・kg-1。然后分别于0.05，0.083 3，0.166 7，0.25，0.333，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0 h静脉取血。将含药血浆置于肝素化的Eppendof管中，于-20 ℃中保存待测。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性考察结果 在本试验条件下，人参茎叶总皂苷中9种人参皂苷成分与内标淫羊藿苷均有良好的分离度，血浆中杂质不干扰目标化合物的测定，表明方法专属性良好。人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd和内标淫羊藿苷的保留时间分别为23.966，24.696，39.988，44.569，45.748，47.563，51.225，52.498，57.799，35.753 min。大鼠空白血浆、加样血浆、含皂苷脂质体血浆、含皂苷水溶液血浆样品的色谱图见图1。

3.1.2 线性关系考察结果 人参茎叶总皂苷中9种人参皂苷成分在0.2～200 mg・L-1质量浓度与峰面积比线性关系良好。定量下限在0.023～0.105 mg・L-1。以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品和内标峰面积比值为纵坐标（Y）进行线性回归。人参皂苷Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rb2，Rb3，Rd的回归方程分别为Y=0.005 3X+0.003 7，R2=0.995 7；Y=0.020 6X+0.066 8，R2=0.991 3；Y=0.066 5X+0.118 3，R2=0.998 7；Y=0.016 0X-0.030 8，R2=0.997 2；Y=0.021 3X-0.005 4，R2=0.999 6；Y=0.030 0X-0.015 5，R2=0.999 5；Y=0.016 3X-0.004 5，R2=0.998 5；Y=0.016 3X-0.010 6，R2=0.997 2；Y=0.033 8X+0.012，R2=0.999 4。

3.1.3 精密度c准确度试验结果 质量浓度分别为2，40，160 mg・L-1人参皂苷样品的批内精密度在0.93%～7.4%，准确度在97.00%～102.9%；批间精密度在0.92%～9.8%，准确度在98.07%～102.7%。

3.1.4 回收率试验结果 质量浓度分别为2，40，160 mg・L-1人参皂苷样品回收率在95.57%～103.2%。

3.2 药动学试验结果

3.2.1 血药浓度-时间曲线 大鼠静脉给药50 mg・kg-1人参茎叶总皂苷水溶液和脂质体后，9种人参皂苷组分血药浓度时间曲线见图2。

3.2.2 药动学参数 血药浓度-时间数据通过软件3p97拟合出大鼠给药后的药代动力学参数，结果见表1～3。Rg1，Re，Rf，Rg2，Rc，Rd和Rb3的水溶液均为二室模型，脂质体为一室模型；Rb1的水溶液和脂质体均为三室模型；Rb2的水溶液为三室模型，脂质体为一室模型。9种皂苷水溶液经静脉给药后，出现的血药浓度峰较脂质体均提前，水溶液的达峰时间一般在0.05～0.083 3 h；脂质体的达峰时间一般在0.5 h之后，达峰时间较长。9种皂苷脂质体的药-时曲线下面积（AUC）均大于水溶液的曲线下面积，而且脂质体在体内停留时间较长，清除率较水溶液的清除率慢，半衰期一般也较水溶液长。因此，脂质体的代谢比水溶液慢。

4 讨论

人参皂苷因其重要的药用价值一直是国内外专家和学者的研究热点。但是人参皂苷在体内的生物利用度较低，难以发挥它的疗效。因此，研发具有缓释长效、生物利用度较高的人参皂苷新剂型具有重要的临床意义。近年来，人参皂苷单体脂质体的制备多见报道，但对于人参茎叶总皂苷脂质体的制备目前尚未报道。由于在人参总皂苷给药体系中，多种人参皂苷存在彼此间增溶等理化性质，最明显的现象就是单体人参皂苷水中几乎不溶或溶解度极低，而总皂苷则在水中溶解度很好，这也导致人参总皂苷的药代动力学性质与单体人参皂苷存在显著差异。本文以人参茎叶总皂苷为研究对象，通过静脉给药方式，研究人参茎叶总皂苷脂质体与其水溶液在大鼠体内血药浓度及药代动力学的参数差异。静脉给药是脂质体常见的给药方式。但是，人参皂苷单体静脉给药在体内代谢较快，虽然起效快，但难以发挥更高疗效。马静等[19]对人参皂苷不同途径给药的药代动力学研究发现，静脉给药后人参皂苷Rg1，Re代谢较快，6 h以后血浆中很难检测到。本试验从9种皂苷2种剂型药时曲线的趋势上分析，水溶液一般在0.5 h以内会出现最高血药浓度峰，主要原因是药物瞬间进入血管内导致较高的浓度，而脂质体由于包裹一层生物膜，具有缓释性，延长了药物的释放，所以出现的血药浓度峰比较晚。研究结果表明，与人参茎叶总皂苷水溶液相比，脂质体在大鼠体内消除速度减慢，AUC明显提高，并且脂质体在一定程度上延长了药物在体内的循环时间，从而提高药物的长效作用。因此，人参茎叶总皂苷脂质体与传统剂型相比，既提高了药物的缓释长效，又不影响药物的起效速度，为今后研发人参皂苷新剂型起到了重要意义。

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