黄芪甲苷调控STAT1/IκB/NF―κB信号通路抑制γ―干扰素诱导BV―2细胞激活

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[摘要]目的：研究黄芪甲苷（ASI）对γ-干扰素（IFN-γ）诱导小胶质细胞激活的抑制作用及机制。方法：不同浓度的ASI（25，50，100 μmol・L^-1）预处理bv-2小胶质细胞2 h后，以IFN-γ刺激1.5 h或24 h，分别收集细胞培养基上清和细胞。分别以Griess和ELISA法检测培养基中一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量;qPCR法检测细胞中CD11b，TNF-α，白介素1β（IL-1β）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA水平;Western blot法检测细胞STAT1/IκB/NF-κB信号通路蛋白表达。结果：ASI能显著抑制 IFN-γ诱导BV-2细胞NO和 TNF-α水平的升高（P<0.001）;进一步研究表明，50 μmol・L^-1ASI能够显著抑制细胞IL-1β和TNF-α的mRNA表达（P<0.01，P<0.05），并表现出下调iNOS mRNA表达的趋势，但对BV-2细胞CD11b的mRNA水平无显著影响;同时，ASI显著抑制IFN-γ诱导上调的 pSTAT1，pIκB和pNF-κB的蛋白表达。结论：ASI能够抑制IFN-γ诱导的小胶质细胞的激活，其机制与其抑制STAT1/IκB/NF-κB信号通路的激活，降低炎症状态下小胶质细胞IL-1β，TNF-α以及iNOS的基因表达，从而减少NO和TNF-α的生成有关。

[关键词]黄芪甲苷;小胶质细胞;神经炎症;STAT1;IκB;NF-κB

[收稿日期]2014-07-15

[基金项目]教育部高等学校博士学科点专项科研基金优先发展领域项目（20123107130002）;上海市教委科研创新重点项目（13ZZ099）;上海高校特聘教授（东方学者）岗位计划项目（2013-59）

[通信作者]*吴晓俊，研究员，Tel：（021）51322578，E-mail：;*王峥涛，教授，Tel：（021）51322507，E-mail：

[作者简介]贺一新，博士研究生，E-mail：

Astragaloside IV regulates STAT1/IκB/NF-κB signaling pathway

to inhibit activation of BV-2 cells

HE Yi-xin1，2， SHI Hai-lian2， LIU Hong-shuai2， WU Hui2， ZHANG Bei-bei2， WU Xiao-jun2*， WANG Zheng-tao1，2*

（1. Department of Pharmacognosy， School of Traditional Chinese Medicine， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009， China;

2. Shanghai Key Laboratory of Complex Prescriptions， Institute of Chinese Materia Medica， Shanghai University of

Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China）

[Abstract]Objective： The study was aimed to investigate the inhibitory effect and mechanism of astragaloside IV （ASI） on the activation of microglial cells. Method：After pre-incubated with ASI for 2 h， microglial cells BV-2 were stimulated with interferon-γ （IFN-γ） for 1.5 h and 24 h， respectively. Secretion of nitric oxide （NO） in the medium was measured by Griess method. Production of tumor necrosis factor alpha （TNF-α） was detected by ELISA approach. Cellular gene expressions of CD11b， TNF-α， interleukin 1β （IL-1β） and induced nitric oxide synthase （iNOS） were examined by quantitative -PCR analysis. Total and phosphorylation of STAT1， IκB and NF-κB was analyzed by Western blot method. Result： ASI could significantly inhibit the increased secretion of TNF-α and NO from BV-2 cells upon IFN-γ stimulation （P<0.001）. Further study showed that ASI significantly down-regulated gene expression of IL-1β and TNF-α （P<0.01， P<0.05） and exhibited a trend to reduce that of iNOS. IFN-γ and ASI have no obvious effect on gene expression of CD11b. Moreover， ASI inhibited the phosphorylation of STAT1， IκB and NF-κB elicited by IFN-γ stimulation. Conclusion： ASI could restrain microglial activation through interfering STAT1/IκB/NF-κB signaling pathway， reducing gene expression of IL-1β and TNF-α， and thus inhibiting the production of proinflammatory mediators such as NO and TNF-α.

[Key words]astragaloside IV; microglia cells; neuroinflammation; STAT1; IκB; NF-κB

doi：10.4268/cjcmm20150124

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的天然免疫细胞，正常静息状态下，小胶质细胞能够清除CNS中入侵的病原体、修复损毁的神经、吞噬碎片以及分泌调节性的免疫分子，发挥其神经保护功能^[1]。但是，在过度而持续激活情况下，小胶质细胞往往产生众多的神经毒性因子，如NO，超氧自由基以及炎症因子（IL-1β和TNF-α），最终导致神经损伤^[2]。以小胶质细胞过度激活为特征的神经炎症和多种神经退行性疾病[如阿尔茨海默氏症（AD）、帕金森氏症（PD）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和多发性硬化症（MS）等]发生和发展密切相关。因此，适度调控CNS中小胶质细胞的激活，对神经系统疾病的治疗大有裨益。

黄芪是我国传统的补气中药，而黄芪皂苷是其有效成分之一，可以调节免疫系统T细胞的分化，并且对神经系统炎症的恢复具有促进作用。黄芪甲苷（astragaloside IV，ASI）是黄芪皂苷中的代表性活性单体成分，可以促进大鼠皮层原代细胞的存活和轴突的生长^[3]。在体研究表明，ASI具有神经保护作用，可以减少原代多巴胺能黑质神经细胞经6-羟多巴胺诱导的神经凋亡^[4]。同时，ASI也可以延缓氢化可的松诱导的大鼠的衰老，并且可能通过降低Ca2+的释放和抑制海马神经元细胞的凋亡而减少大鼠记忆的损伤^[5]。前期的研究表明，ASI可以显著抑制MS动物模型EAE小鼠的发病，并且可以剂量依赖性抑制IFN-γ诱导小胶质细胞BV-2中iNOS的产生^[6]。但是ASI对小胶质细胞激活作用机制目前尚不清楚，本研究旨在考察并阐明ASI对IFN-γ诱导BV-2细胞激活的抑制作用及其分子机制。

1材料

1.1细胞株与药物小鼠小胶质细胞BV-2细胞株购自ATCC。黄芪甲苷（纯度>98%）购自上海中药标准化研究中心。

1.2试剂TNF-α检测试剂盒（eBioscience）购自上海新博奥公司;NO检测试剂盒、细胞裂解液及磷酸酶抑制剂1和2购自Sigma公司;DMEM培养基（Hyclone）购自Thermo公司;胎牛血清（Gibco）购自Life Technology公司;BCA蛋白定量试剂盒购自上海鼎国生物;ECL-prime，Amersham Hybond-P PVDF转移膜购自GE Healthcare;RNA提取试剂盒（TakaRa）购自大连宝生物;pNF-κB 抗体、NF-κB抗体、IκBα抗体、pIκBα抗体、β-actin抗体、stat1抗体和pSTAT1 抗体（C.S.T.）购自上海优宁维。

2方法

2.1BV-2细胞培养BV-2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基（100 U・mL^-1青霉素和100 mg・L^-1链霉素双抗），37 ℃，5%CO2培养箱中培养并继代。

2.2NO及Tnf-α含量测定取对数生长期的BV-2细胞，按1.5×106个/mL的浓度接种于24孔细胞培养板中培养过夜。实验分组如下：空白组（无药物处理），模型组（100 μg・L^-1IFN-γ刺激24 h），药物处理组（分别用10，25，50，100 μmol・L^-1ASI预处理2 h后，再经过100 μg・L^-1IFN-γ刺激24 h）。处理结束后，取培养基上清，分别测定其中NO及TNF-α含量。

NO含量测定如下：取80 μL培养基与等体积Griess试剂混合，静置15 min后，使用酶标仪于540 nm波长处测定吸光度，以NaNO2为标准品绘制标准曲线，计算培养基中NO的含量。

TNF-α含量测定如下：取100 μL培养基，按TNF-α检测试剂盒操作说明操作，最后用酶标仪于450 nm波长处读取吸光度，以TNF-α标准品绘制标准曲线，计算培养基中TNF-α的含量。

2.3炎症因子基因表达分析按照上述分组及药物处理方法处理细胞，处理结束后，Trizol法提取RNA，Nanodrop蛋白核酸分析仪测定RNA浓度。取2 μg总RNA，应用反转录试剂盒（Thermo）逆转成cDNA。将上述转录产物cDNA，用ddH2O按1∶5比例稀释后作为模板，根据Takara SYBR Green荧光定量试剂盒的操作说明对细胞中CD11b，IL-1β，TNF-α及iNOS基因表达进行定量，内参基因选用GAPDH，引物序列见表1。PCR反应条件如下：95 ℃预变性30 s后进行95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环的扩增反应。

2.4信号蛋白表达检测取对数生长期的BV-2细胞，按1.5×106个/mL的浓度接种于6孔细胞培养板中培养过夜。实验分组如下：空白组（无药物处理），模型组（100 μg・L^-1IFN-γ刺激1.5 h），药物处理组（50 μmol・L^-1ASI预处理2 h后，再加入100 μg・L^-1IFN-γ刺激1.5 h）。处理结束后，弃培养基，4 ℃PBS 清洗1遍，每孔加100 μL裂解液（含1%的磷酸酶抑制剂1和2），冰上裂解10 min后，15 000 r・min^-1，4 ℃离心15 min。取上清，BCA法测定蛋白浓度。

分别取20 μg样品，进行SDS-PAGE 电泳。电泳结束后，湿法转膜1 h，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别孵育相应的一抗（抗体稀释度参照说明书进行），4 ℃孵育过夜，然后分别与HRP标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗孵育，常温摇床1 h，最后以ECL-prime试剂盒显色，暗房曝光、显影及定影。

2.5统计分析所有数据用±s表示，采用PrismDemo 5.0统计软件进行统计分析，多组比较经One-way ANOVA Dunnett检验，P<0.05表示有统计学意义。

3结果

3.1ASI对IFN-γ诱导BV-2细胞NO及TNF-α生成的抑制作用Griess及ELISA检测结果显示，与空白组相比，IFN-γ能显著增加BV-2细胞NO的释放（P<0.001），而各剂量ASI处理均能显著抑制其释放（P<0.001）;与此相类似，IFN-γ刺激同样能显著促进细胞分泌TNF-α（P<0.001），但10 μmol・L^-1ASI不能抑制其分泌，而25，50，100 μmol・L^-1ASI均能显著抑制TNF-α的生成（P<0.001），见图1。

3.2ASI对IFN-γ诱导BV-2细胞基因表达的影响与空白组相比，IFN-γ刺激能够显著上调BV-2细胞IL-1β（P<0.001），TNF-α（P<0.001）及iNOS（P<0.001）的基因表达;而50 μmol・L^-1ASI处理能够显著抑制IL-1β（P<0.01）和TNF-α（P<0.05）的基因表达，并且表现出下调iNOS基因表达的趋势。IFN-γ和ASI对BV-2细胞CD11b的基因表达无明显作用，见图2。

3.3ASI对BV-2细胞STAT1/IκB/NF-κB信号通路的影响研究表明IFN-γ通过STAT1/IκB/NF-κB信号通路诱导细胞炎症反应。和文献报道相一致，本研究结果表明，IFN-γ刺激可以显著提高BV-2细胞中STAT1，IκB以及NF-κB的磷酸化水平，这一作用可被50 μmol・L^-1ASI抑制。由此可知，ASI可能通过调控STAT1，IκB和NF-κB蛋白的活化，抑制了BV-2细胞的激活，进而阻止了下游炎症因子的产生，见图3。

4讨论

ASI作为天然药物中的活性物质，文献表明其有抗氧化、促进轴再生和突触重建作用^[4-5]。作者的前期研究表明，ASI可以抑制EAE小鼠中枢神经系统中小胶质细胞的激活，而体外研究亦表明它可以

剂量依赖性抑制IFN-γ诱导BV-2细胞iNOS的生成。在本研究中，进一步发现ASI可以显著抑制IFN-γ诱导BV-2细胞炎症因子NO和TNF-α的生成，而这种抑制作用可能是通过调节STAT1/IκB/NF-κB信号通路，进而调控炎症因子基因表达作用而实现。

小胶质细胞是神经胶质细胞的一种，同时是脑和脊髓中的巨噬细胞，具备巨噬细胞的特点，发挥免疫防御作用，帮助机体抵御入侵的病原体，并兼具神经保护作用^[7-8]。小胶质细胞激活是神经炎症的表征之一，失控或过度激活的小胶质细胞产生较多的致炎因子，包括NO，TNF-α，IL-1β等，易引发神经毒性，造成神经损毁^[9]。本研究结果显示，ASI可以显著抑制IFN-γ诱导BV-2细胞炎症因子基因或者蛋白的表达，表明ASI对小胶质细胞激活具有显著抑制作用。

NF-κB在慢性神经炎症中扮演重要角色，往往与炎症因子的产生密切相关^[10]。在非激活状态下，NF-κB以p50/p65异二聚体形式存在于细胞浆中，与其抑制性蛋白IκB结合而呈非活性状态。在诱导因子如IFN-γ、脂多糖和自由基等作用下，IκB被磷酸化，进而泛素化并被降解，从而释放出活化的NF-κB分子，启动其转位入核与靶基因的启动位点结合，诱导不同致炎因子的表达。STAT1 是信号转导子和转录活化子（signal transducer and activator of transcription，STAT）家族的重要成员，在被细胞因子IFN-γ等诱导激活的JAK2作用下，胞浆中的STAT1被激活并形成二聚体，继而进入细胞核并促进相应靶基因转录^[11]。

在体内，IFN-γ主要由T淋巴细胞、NK细胞和NKT细胞在受到免疫或者炎症刺激条件下产生^[12]。而IFN-γ往往可以诱导小胶质细胞STAT1，NF-κB，IRF-1等转录因子的激活，表达众多的炎症介质，如NO，IL-1β，TNF-α，MCP-1等^[13]。

本研究结果表明，ASI可以显著抑制IFN-γ诱导的BV-2细胞pSTAT1，pNF-κB，pIκB表达，进而减少细胞炎症介质TNF-α，IL-1β及iNOS的基因表达，降低了炎症因子NO和TNF-α的释放。

综上所述，ASI可以显著抑制IFN-γ诱导的BV-2小胶质细胞的激活，其机制与其抑制STAT1/IκB/NF-κB信号通路的激活有关，提示其可用于治疗与小胶质细胞炎症激活有关的神经退行性疾病的治疗。

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