OP对生物监测的影响
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作者：刘萍邬春华刘弘周志俊单位：复旦大学公共卫生学院教育部公共卫生安全重点实验室上海市疾病预防控制中心
有机磷农药（organophosphoruspesticides,OP)在世界范围内广泛使用，可通过皮肤、消化道和吸入等途径对人畜产生较高毒性，常因使用或保管不慎发生中毒。通常认为食品是一般人群接触OP的主要来源。同时，OP的残留物也会对生物造成长期慢性危害，Fenske等[1]发现室外的OP因水解和光照能很快降解，但室内环境中的OP性质相对稳定，衰减周期较长。成人和儿童都可能在反复接触过程中受到影响，长期低剂量接触OP对人群健康的影响已成为毒理学、环境流行病学等研究的热点。OP的代谢产物二烷基磷酸酯类（DAPs）常被用作OP暴露评估的生物标志物，在农药风险评估中发挥重要作用。笔者拟就OP在环境中的主要降解机制、DAPs在生物监测中的应用进展，分析食品中OP及DAPs残留对生物监测的影响，并且提出新的OP暴露评估策略。
1OP的结构、性质及其在环境中的主要降解机制
大多数OP为磷酸酯类或硫代磷酸酯类化合物，其结构通式如下：式中：R1、R2在我国目前的生产品种中多为甲氧基（CH3O）或乙氧基（C2H5O）；X为氧（O）或硫（S）原子；Z为烷氧基、苯氧基或其他更为复杂的取代基团。无论是在环境中还是动植物体内，水解和氧化都是OP的主要降解途径[2]。大部分OP的最终水解产物都包括一种或一种以上二烷基磷酸酯类化合物（DAPs）。这些水解产物分别为磷酸二甲酯(dimethylphosphate，DMP)、磷酸二乙酯(diethylphosphate，DEP)、二甲基硫代磷酸酯(dimethylthiophosphate，DMTP)、二乙基硫代磷酸酯(diethylthiophosphate，DETP)、二甲基二硫代磷酸酯(dimethyldithiophosphate，DMDTP)、二乙基二硫代磷酸酯(diethyldithiophosphate，DEDTP)。其中DMP、DMTP、DEP和DETP在普通人群的尿样中也经常能测得。DAPs被普遍用作人群OP暴露评估的生物标志物。另一方面，蔬菜和水果上残留的OP也被证实能降解为DAPs[3]，但其降解程度以及与OP共存的DAPs总量仍有待进一步探讨。
OP在环境中的降解分为生物降解及非生物降解。生物降解是指OP在微生物酶的作用下发生降解。如马拉硫磷可被土壤中假单胞菌的可溶性脂酶水解，生成羧酸衍生物；对硫磷在微生物作用下发生水解，生成DETP。OP的非生物降解又分为吸附催化水解和光降解。其中吸附催化水解是OP在环境中的主要降解途径。
在土壤的吸附催化作用下，大部分OP能水解为一种或一种以上DAPs。OP多数是酯类，因此在土壤中极易发生水解。马拉硫磷在pH=7的土壤体系中水解半衰期为6~8h，丁烯磷在同样条件下半衰期为2h。但离开土壤后半衰期就会长达14~20d[4]。因此水果和蔬菜从最后一次施农药到食用必须有一段安全间隔期。非生物的另一条降解途径是光降解。太阳辐射和紫外线照射使农药分子中的化学键断裂，形成异常活泼的自由基。自由基再与溶剂或其他反应物作用得到光解产物。有机磷酸酯类农药的光解过程可用下式表示：多数有机磷酸酯类农药的降解产物毒性降低，但有些硫代磷酸酯类农药可能转变为毒性更强的化合物。如乐果会在潮湿空气中由光解途径生成高毒氧化产物———氧化乐果，它比乐果本身对温血动物的毒性更大。
2DAPs在生物材料中的检测及其在暴露评估的应用
由于人体接触OP的途径多种多样，而主要的暴露方式又因人而异，评价OP的接触水平可通过环境与生物监测。生物监测研究中的样品有尿样、胎粪、头发等，其中最常用的方法是检测尿中6种OP代谢产物———DAPs。大多数OP进入人体后通常在24h内水解为一种或多种DAPs，因此DAPs在某种程度上能代表OP近期的暴露水平。但是尿中的DAPs还包括环境和食品中的天然本底DAPs以及OP被摄入前已在环境中降解形成的DAPs（图1），DAPs的生物监测可能会过高估计OP在一般人群中的暴露水平。另一方面，每种DAPs都能由多种OP在体内代谢生成，若没有详细的背景资料，就无法将尿中检出的DAPs与某种OP农药确切对应起来。尽管如此，在美国EPA登记的OP农药中75%都能生成一种或多种DAPs，且人体在接触低剂量OP后仍能从尿中检出DAPs，故DAPs目前被普遍用作人群OP暴露评估的生物标志物。表1是我国25种常用的OP及其对应的DAPs代谢产物。
美国疾病预防控制中心(CDC)开展的全美人群健康和营养调查（NHANES）将DAPs分析也纳入研究项目[5-7]。该调查所搜集的样品显示，美国一般人群尿DAPs水平普遍低于意大利和德国小规模研究的调查数据[5]。经肌酐校正的尿DMP和DEP的中位数分别为0.76和0.86μg/g，而德国人群数据则为15.5和2.10μg/g[8]。另外，6~11岁儿童尿中的DAPs浓度显著高于成人和青少年[9]。在性别、种族方面尿DAPs浓度差异无统计学意义。Curl等[10]研究还表明，日常饮食对体内的DAPs水平有一定影响。摄入有机食品（在生产和加工过程中严禁施用农药、化肥、激素等人工合成物的食品）的观察对象尿中的DAPs水平低于普通饮食的人群。本实验室的小样本研究发现，国内一般人群尿DAPs背景值远远高出国外水平[11]。经肌酐校正的尿DMP和DEP的中位数分别为170μg/g和114μg/g。王沛等[12]对193例19~45岁孕妇尿样进行DAPs检测，发现尿DAPs值也超出国外研究水平。其中个别尿中DAPs水平甚至超过NHANES研究结果的100倍。其显著的差异性可能是由于不同地域间OP的使用量和种类不同造成的，同时人种、年龄、季节等因素也会对研究结果造成影响。尿DAPs检测也常用于职业暴露评估。Fenske等[13]发现部分职业人群（农民、农药生产工人等）体内DAPs的水平已超过一般人群平均水平的50倍。本实验室也曾对乐果包装工人的班前及班后尿样进行检测[11]，发现班后尿样中的DAPs水平远远超过国内普通人群。尿中DAPs浓度会随着农药施放方式、不同季节的农药选择发生改变。一天内重复检测多次或连续检测数天的结果都很不稳定。这就说明暴露方式、采样时间、农药在体内的消长等都会对职业暴露评估造成影响[8]。
职业人群家庭中的儿童和孕妇与一般人群相比也有相似或稍高的DAPs水平[14]。有时因季节或作物的影响，农业地区儿童尿DMTP浓度会高出其他地区儿童10倍以上[15]。但大多研究表明这些较高的暴露水平没有超过安全阈值。另外，Young等[16]发现农业地区孕妇产前尿中的DAPs与新生儿反射异常存在一定关联性。Rothlein等[17]利用尿DAPs水平对职业人群神经慢性损害进行危险度评价。结果表明尿中长期低剂量存在的DAPs与神经行为失调有关。但这并不能说明DAPs对人体健康有负作用。DAPs生物监测能间接反映人群OP暴露水平，近年来也在农药暴露—健康效应研究中发挥作用，但它作为暴露指标的实用性和参考价值还有待进一步探讨。
3食品中OP及DAPs残留水平研究
2003年Krieger等[18]经过长年的研究和观察后认为，尿DAPs的来源包括OP在人体中的代谢产物、食品中OP的降解产物及其他多种来源（图1）。用32P进行同位素追踪后发现，在市场随机选取的12个蔬菜样本中均含有DAPs，它们都经过OP残留检测并符合限量规定。将DAP和OP数据从质量水平转换成摩尔数值进行比较，发现DAPs残量和原型OP的摩尔比范围从0.1到130以上。有1/2的样品其DAPs含量超过原型OP。这说明直接用DAPs推算人群OP暴露总量会造成假阳性误差。
Duggan等[19]将美国CDC第二次NHANES报告中[7]的DAPs数据推算成人体暴露OP均值，与EPA在注册合格决定文件（RegistrationEligibilityDecisionDocuments，REDs）中的OP暴露总量进行比较。REDs中OP暴露总量由饮食、饮水、生活环境接触这三部分累计而成。其中饮食和饮水中的OP总量还不到DAPs推测数据的2%。在超过96%的人群中，DAPs推测所得的OP水平为饮食和饮水OP总量的50倍。目前还没有OP生活环境接触数据能对这两者的差距作出解释。较易接受的说法是人群从饮食途径大量摄入了DAPs本体。由于食品中大部分OP半衰期小于5d，人们摄入的降解产物DAPs本体水平远远大于食物中残留的OP。
为调查水果和蔬菜中有多少残留OP转化为DAPs，Zhang等[20]检测了153份样品中的OPs和DAPs（OPs均低于美国国家安全限量）。其中91份样品（60%）的DAPs含量超过了原型OP。此后，他们又验证了随着时间推移蔬菜和水果中的农药原型会逐渐降解为DAPs，而DAPs较原型OP在环境中更为持久。Lu等[21]从未施用农药的有机水果的果汁中检测出DAPs，进一步证明人体能通过OP低残留食品摄入一定量DAPs。OP和DAPs在定量方面的关联性再次遭到质疑。
Curl等[10]对DAPs作为生物标志物的可靠性也提出了不同看法。首先，被植物降解的OP不仅能转化为为二烷基磷酸酯类，还能生成单烷基磷酸酯和磷酸[2]这类对评估毫无影响的化合物。其次，若食物中确有一部分天然存在的DAPs，它们被人体摄入后是否参与代谢，有多少完全以原型从尿中排出还有待研究。目前仅有一篇报道[22]进行了相关动物实验。大鼠被给予1g/kg原型DAPs后，尿中只检出少量。这就提示了DAPs以原型进入生物体后更可能参与代谢转化，以其他形式排出体外。最后，动物实验表明不只一种DAPs能抑制大鼠脑内的胆碱酯酶，这就提出了DAPs本身是否也会对人体造成危害的疑问。但目前还没有充分的人群流行病学证据作出解答。
4食品中DAPs检测策略及结果解释局限性
尽管目前DAPs是人群OP暴露评估的主要生物指标，但近年来的研究表明它仅能作为人群背景暴露值的参考上限。由于生物监测无法区分尿DAPs是OP的环境降解产物还是生物代谢产物，环境和食品中又存在一定量除OP降解途径外形成的DAPs，由DAPs推算OP的暴露水平必须非常谨慎。笔者在此提出一种策略，评价OP通过饮食途径在人群中的暴露水平：首先检测食品中已存在的DAPs总量，接着运用酶水解将OP在食品中的残留物降解为DAPs并再次检测，最后将后者的数据与前者相减，其差值就可代表OP直接降解产物的水平。该方法免去了食品中多种OP检测的繁琐操作。计算所得的DAPs差值相当于食品中所有OP的暴露总和，通过查阅已知OP的代谢产物（见表1），可一次性对食品中的全部已知OP进行定量。又因为本方法考虑到了环境本底和OP自然代谢形成的DAPs高水平，弥补了生物监测过高估计的缺点。
需要指出的是，DAPs作为暴露评估标志物存在以下局限：（1）6种DAPs能由至少31种常用OP转化而成。每一种农药的毒性不同。评价中采用共同的降解产物作为指标，势必会丢失毒理学方面的重要信息，无法正确估计农药联合作用的毒性大小。（2）一般而言，DAPs的毒性远远小于OP的氧化产物。而且DMP和DEP经常出现在健康人群的尿样中。目前尚没有证据证明DAPs对人体胆碱酯酶也有抑制性，DAPs定量在风险评价中的实用性还有待进一步研究。
美国EPA曾在REDs中通过累计人群多途径暴露量估计OP暴露水平，事实证明存在许多缺陷和假设不当。用DAPs进行暴露水平监测虽也有上述不足，但胜在较为简单、快速。虽然DAPs指标在OP定量方面需要慎重，但依然不能否定它在农药暴露评估中的积极作用。