mTOR/p70S6K信号通路在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义
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【摘要】 目的：探讨mtor/p70s6k信号通路在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义。方法：采用天津市中心妇产医院2011年1-6月手术标本120例，其中正常卵巢组（Ⅰ组）、上皮性良性卵巢肿瘤组（Ⅱ组）、上皮性卵巢癌组（Ⅲ组），每组各40例。免疫组化染色检测mTOR、p70S6K在上皮性卵巢组织中的表达。反转录（RT）-PCR法测mTORmRNA、p70S6KmRNA的表达。采用Kaplan-Meier和log-rank检验进行单因素生存分析，比较mTOR、p70S6K蛋白表达水平（阴性、阳性组）的卵巢癌患者的生存率。结果：免疫组化染色显示：mTOR、p70S6K在Ⅰ组卵巢组织中表达很低，Ⅱ组卵巢组织中表达次之，而在Ⅲ组卵巢组织中却高表达。与Ⅰ组比较，Ⅱ组、Ⅲ组mTORmRNA、p70S6KmRNA的表达增加，与Ⅱ组比较，Ⅲ组mTORmRNA、p70S6KmRNA的表达增加。非参数分析显示，上皮性卵巢癌组织中mTOR、p70S6K蛋白表达水平与手术病理分期（P=0.039、0.022）和病理分级（P=0.047、0.037）相关，与患者年龄、病理类型、腹膜转移无关（P>0.05）。单因素生存分析显示，mTOR、p70S6K蛋白的表达阴性与阳性的总生存时间比较，差异有统计学意义（P=0.021）。结论：mTOR/p70S6K信号通路在上皮性卵巢癌的发生、发展、转移和预后中可能起重要作用。
【关键词】 mTOR； p70S6K； 上皮性卵巢癌
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mTOR/ p70S6K signaling pathways in epithelial ovarian cancer and their significance.Method：120 surgical specimens in Tianjin Center Maternity Hospital from January 2011 to June 2011 were selected，they included the normal ovarian group（group Ⅰ），the epithelial ovarian benign ovarian tumor group（group Ⅱ），epithelial ovarian cancer（group Ⅲ），40 casess in each group.The expression of mTOR，p70S6K in epithelial ovarian tissue was detected by immunohistochemical staining.The expression of mTORmRNA，p70S6KmRNA were detected by Reverse transcription（RT）-PCR method.Using Kaplan Meier and log-rank test of single factor analysis，the mTOR，p70S6K protein expression level（negative and positive group） of ovarian cancer patients’ survival rate were compared.Result：Immunohistochemical staining showed that mTOR，p70S6K expressed in ovarian tissue of group Ⅰ was very low，the expression of ovarian tissue in group Ⅱ followed by，and it was highly expressed in ovarian tissue of group Ⅲ.The expression of mTORmRNA and p70S6KmRNA in group Ⅱ，Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅰ，and the expression of mTORmRNA and p70S6KmRNA in group Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅱ.Nonparametric analysis showed that the expression level of mTOR，p70S6K in epithelial ovarian cancer were correlated with the surgical pathologic stage（P=0.039，0.022） and pathologic grade（P=0.047，0.037），had nothing to do with patients’ age，pathological type，peritoneal metastasis.Single factor survival analysis showed that mTOR，p70S6K protein expression of total survival time in negative and positive，the difference was statistically significant（P=0.021）.Conclusion：The higher expressions of mTOR/ p70S6K signaling pathways are related to occurrence，development，metastasis and prognosis of epithelial ovarian cancer.
【Key words】 mTOR； p70S6K； Epithelial ovarian cancer
First-author’s address：Tianjin Medical University，Tianjin 300000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.001
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位[1]。但卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁[2]，明确其发病机制，可为有效治疗卵巢上皮癌提供帮助。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是近年来研究的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其可通过整合能量状态，激素、细胞、氨基酸、细胞氧化应激等信号，通过影响蛋白质的合成，调节细胞生长、增殖、凋亡、自噬等多个生物学过程[3]。p70S6激酶（p70S6K）作为mTOR蛋白的下游底物，被磷酸化的mTOR激活后可以调控细胞内p70S6KmRNA的翻译[4]。研究表明，mTOR/p70S6K信号通路的激活与乳腺癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关[5]，但mTOR/p70S6K信号通路是否在上皮性卵巢癌组织中有表达，国内外尚无相关报道。本研究拟探讨mTOR/p70S6K信号通路在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义，为卵巢上皮癌的治疗提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料 采用天津市中心妇产医院2011年1-6月手术标本共120例，其中包括正常卵巢组（Ⅰ组）、上皮性良性卵巢肿瘤组（Ⅱ组）、上皮性卵巢癌组（Ⅲ组），每组各40例。所有病例为初发，术前未行任何治疗且肝肾功能正常，无合并妊娠或近期妊娠史。上皮性卵巢癌组患者年龄为35～70岁。按国际妇产科联盟FIGO分期2009年标准：Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期26例。腹膜转移27例，无腹膜转移13例。组织学分级（世界卫生组织WHO，2003）：G1级12例，G2级17例，G3级11例。病理类型：浆液性腺癌22例，黏液性腺癌18例。均取卵巢癌原发灶组织进行试验。40例上皮性良性卵巢肿瘤标本均为同期在该院手术获得。对照组为随机选取的同期围绝经期女性因子宫肌瘤接受手术要求切除双附件治疗获得的正常卵巢组织标本，共40例。标本离体5min内经液氮速冻后置-80 ℃冰箱保存备用，所有组织用10%甲醛固定，常规石蜡包埋。术后进行随访至2015年6月1日。
1.2 试剂 BIOZOL总RNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司），BIORT逆转录扩增试剂盒（杭州博日科技有限公司），mTOR引物（上游引物批号02116，下游引物批号02117）、p70S6K弓I物（上游引物批号02118、下游引物批号02119）以及B.actin内参引物（上游引物批号37496、下游引物批号37495）均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品，焦碳酸二乙脂（DEPC，BBI公司，批号DB0154）溴化乙锭（EB，TaKaRa公司）琼脂糖，无水乙醇，DNAMark（DL2000，TaKaRa公司），GeneAmp 5700型PCR仪（美国应用生物系统公司），凝胶电泳成像系统（Transilluminator公司），紫外分光光度计（Cary-50）（澳大利亚Varian公司）。
1.3 免疫组化染色检测mTOR、p70S6K在上皮性卵巢组织中的表达 参照文献[6]采用SP法进行免疫组化染：每批染色均设阴性对照。阴性对照采用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒者为阳性细胞，根据阳性细胞所占百分比及阳性细胞染色强度进行评分，具体如下，（1）阳性细胞所占百分比评分：无阳性细胞者记0分，≤5%者记1分，>5%～25%者记2分，>25%～50%者记3分，>50%者记4分；（2）染色强度评分：未着色记0分，淡黄色记1分，黄色记2分，棕黄色记3分；两种评分相加为总分：总分0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分
为中等阳性（++），≥6分为强阳性（+++）。以+～+++为阳性标本，计算阳性表达率。
1.4 反转录（RT）-PCR法测mTOR、p70S6KmRNA的表达 按BIOZOL总RNA提取试剂盒说明进行提取组织总RNA，逆转录合成cDNA按BIORT逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒说明进行，引物设计参考文献[7]，mTOR上游引物为5’-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3’，下游引物为5’-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3’，共537 bp，p70S6K上游引物为5’-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3’，下游引物为5’-GATGAAGGGATGCTTTACT-3’，共188 bp，内参选用β-actin：上游引物为5’-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3’，下游引物为5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’，共302 bp，反应总体积25 μL.10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPMixture（10 mmol/L）0.5 μL，每管加入mTOR上下游引物或者p70S6K上下游引物各0.5 μL，上下游内参各
0.5 μL，Taq mixDNA polymerase0.5 μL，RT产物2.5 μL，
ddH2O 17 μL。PCR反应条件：94 ℃3 rain预变性：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 90 s，共经过35个循环反应。所得PCR产物在含溴化乙锭的1.5 g/L的琼脂糖凝胶中电泳分离，然后用凝胶成像系统分析结果。
1.5 随访 以电话或来院复查形式对40例卵巢癌患者进行随访，随访始于卵巢癌确诊后，随访截止时间为2015年6月，随访时间为1～50个月（中位随访时间25个月）。
1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，随机区组设计的计量资料采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料采用重复测量设计的方差分析，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验或Fisher确切概率法、最小显著差数法（LSD）检验。用Kaplan-Meier法计算生存率，对生存率曲线比较采用log-rank法进行显著性检验，以P
2 结果
2.1 免疫组化染色检测mTOR、p70S6K在上皮性卵巢组织中的表达 从免疫组化染色检测结果可以看出，mTOR蛋白定位于胞浆，p70S6K蛋白定位于细胞核，在Ⅰ组卵巢组织中表达很低，Ⅱ组卵巢组织中表达次之，而在Ⅲ组卵巢组织中却高表达。Ⅰ组患者卵巢组织中mTOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为2.5%、2.5%，Ⅱ组患者卵巢组织中mTOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为12.5%、20.0%，Ⅲ组患者卵巢浆液性腺癌组织中mTOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为45.5%、59.1%，黏液性腺癌组织中mTOR、p70S6K蛋白的阳性率表达分别为66.7%、61.1%，详见图1～2、表1。
2.2 反转录（RT）-PCR法测mTORmRNA、p70S6KmRNA的表达 与Ⅰ组比较，Ⅱ组、Ⅲ组的mTORmRNA、p70S6KmRNA的表达增加，与Ⅱ组比较，Ⅲ组mTORmRNA、p70S6KmRNA的表达增加，见表2。
2.3 mTOR、p70S6K 蛋白表达与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系 非参数分析显示，上皮性卵巢癌组织中mTOR、p70S6K蛋白表达水平与手术病理分期（P=0.039、0.022）和病理分级（P=0.047、0.037）相关，与患者年龄、病理类型、腹膜转移均无关（P>0.05），见表3。
2.4 mTOR、p70S6K蛋白的表达水平与上皮性卵巢癌患者预后比较 单因素生存分析显示，mTOR、p70S6K蛋白的表达阴性与阳性的总生存时间比较，差异有统计学意义（P=0.021），见图3。
3 讨论
目前，卵巢恶性肿瘤死亡率居妇科恶性肿瘤的首位，上皮性卵巢癌约占90%，所以上皮性卵巢癌成为最受关注的妇科恶性肿瘤之一，其发生发展非常隐匿，通常患者没有特异性症状，仅到病情发展到一定程度才呈现出腹胀、腹部包块等症状和体征。因此多数患者确诊时已属晚期，手术和辅助治疗的效果不理想，预后差，5年生存率低[8]。所以有必要了解卵巢癌发生发展的机制，为寻找遏制肿瘤细胞的致瘤能力的方法奠定基础。目前，信号传导系统的缺陷和异常活化与肿瘤发生、发展及预后的关系已成为肿瘤分子生物学的研究热点，同时通过干预信号传导途径治疗肿瘤也成为生物治疗的新兴领域。
mTOR是一种编码2549个氨基酸的丝/苏氨酸蛋白激酶，分子量约289 kDa，其C末端与PI3K的催化结构域具有高度同源性，故而属于PI3K蛋白家族成员。由于mTOR信号转导通路在细胞周期进程中发挥了重要作用，而细胞周期进程的异常调节与癌症有关，因此mTOR信号通路在癌症的发生、发展中处于核心地位[9]。Murayama等[10]发现细胞质中mTOR的表达与胃肿瘤浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期明显正相关。另有研究报道，在手术切除的胰腺导管癌标本中，胰腺癌细胞中mToR被激活，而且，mToR抑制剂对胰腺癌具有潜在的抗癌活性[11]。综上可见，mTOR在许多恶性肿瘤组织中高表达，提示mTOR可能参与了恶性肿瘤的发生和发展过程。
p70S6K作为mTOR下游的主要靶蛋白之一，是mTOR下游底物中目前研究较为广泛的关键调节因子，具有核糖体蛋白激酶的活性，活化后能够磷酸化激活核糖体40S小亚基S6蛋白，而S6蛋白可提高含5’-TOP的mRNA的翻译效率[12]，当其第389位苏氨酸残基（Thr389）被磷酸化后，活性上升，促进核糖体及其他调节蛋白的合成，介导细胞生长和增殖[13]，同时，mTOR的主要生物学功能也是通过p70S6K来实现的。因此本研究观察mTOR和p70S6K蛋白表达。
本研究通过免疫组化染色检测发现mTOR、p70S6K在正常上皮性卵巢组织中表达很低，而在上皮性卵巢癌组织中却高表达；mTOR、p70S6KmRNA的表达增加并且与病理分级相关，其机制可能是上皮性卵巢癌中LKB1激活[14]，使其下游mTOR激活，mTOR是大多数细胞分裂增殖信号传导的中枢可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期进展，促进细胞的生存和增殖。mToR信号通路不仅对正常细胞生长增殖起着重要作用，而且与正常细胞向癌细胞转化以及癌细胞的生长、增殖密切相关，同时参与血管形成，在肿瘤的形成中扮演重要角色，并参与肿瘤的侵袭和转移[15]。mTOR激活后，使其下游p70S6K激活，促进p70S6KmRNA翻译活性增强，协同刺激癌细胞蛋白质及核糖体合成，从而控制细胞从G1期到S期，促进癌细胞生长及增殖[16]。
综上所述，mTOR/p70S6K信号通路在上皮性卵巢癌组织中的高表达，提示mTOR和p70S6K蛋白可能是一种新的癌基因，其对卵巢癌患者的预后可能有预测价值。该信号通路将可能成为认知和探索上皮性卵巢癌形成机制新的研究方向，以此为靶向的早期干预治疗有待进一步的深入研究。
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（收稿日期：2015-07-27） （本文编辑：欧丽）