温化痰湿法对实验性抑郁大鼠脑内氧自由基的影响

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摘要 目的：研究中医温化痰湿法对实验性抑郁大鼠脑内氧自由基损伤的作用。方法：将40只SD大鼠随机分为中药组、西药组、模型组和空白组，十味温胆汤为中药干预，西药百优解为对照，观察其对采用孤养与慢性轻度不可预见性应激（CUMS）相结合造成的抑郁大鼠脑内一氧化氮合酶（NOS）、超氧歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量的影响。结果：十味温胆汤能明显抑制抑郁模型大鼠脑内NOS活性，降低MDA含量，各组大鼠脑内SOD活性变化无统计学意义。结论：温化痰湿法具有一定的对抗造成实验性抑郁大鼠脑组织中自由基损伤的作用。

关键词 大鼠抑郁模型 温化痰湿法 一氧化氮合酶 丙二醛 超氧歧化酶

抑郁症是以情感性心境障碍为主要临床表现的心理疾病，其发病机理非常复杂，已有的关于抑郁症的理论包括5-羟色胺学说、多巴胺学说等多个方面。近年来,大量研究表明氧自由基和一氧化氮(NO)可能在神经精神疾病的发病病理过程中起着重要的作用[1]。因此,自由基学说逐渐地引起了人们的重视。抑郁症在中医学属于“郁证”的范畴，痰湿致病是其重要的发病机制。南宋陈无择在《三因极一病证方论》就提出：“七情扰乱，郁而生痰”,指出了痰湿在抑郁症的发病过程中的重要意义。本文采用十味温胆汤作为温化痰湿法的治疗方剂，对造成实验性抑郁的大鼠进行了干预，观察温化痰湿法能够对大鼠脑内一氧化氮合酶（NOS）、超氧歧化酶活性及丙二醛（MDA）含量产生的影响。报道如下。

1 材料与方法

1．1 动物：6周龄健康SD雄性大鼠，40只，清洁级，体重200±10g，由浙江中医学院实验动物中心提供。

1．2 药品与试剂：中药十味温胆汤由人参、酸枣仁、远志、五味子、熟地黄各3g，半夏、枳实、陈皮各9g，白茯苓5g，粉甘草2g组成。水煎，浓缩成生药含量1g/ml的水剂置4℃冰箱备用。盐酸氟西汀（百优解）生产厂：Eli lilly and company Limited；分装厂：礼来苏州制药有限公司分装厂分装，批号：H20050463；生理盐水，浙江沙普爱思制药有限公司，国药准字：H33021037。将盐酸氟西汀粉剂溶解于生理盐水中，按含药量1mg/ml配制成水剂备用。蛋白标准液0．615g/ml；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒,批号20070123；一氧化氮合酶（NOS）分型测定试剂盒，批号20070120；丙二醛（MDA）测定试剂盒，批号20070124；超氧化歧化酶（SOD）测定试剂盒批号，20070123；均购自南京建成生物工程研究所。

1．3 主要仪器及设备：FA25型号实验室高剪分散乳化机，上海弗鲁克机电设备有限公司；723P型可见光分光光度计，上海光谱仪器有限公司；Avanti J-E型Beckman高速离心机，美国Beckman Coulter。

1．4 分组及给药方法：大鼠饲养1周，自由进食饮水以适应环境，实验人员每日触摸动物使其适应操作。所有大鼠随机分为空白组、中药组、西药组、模型组，每组10只。中药组在每天刺激前分别灌“十味温胆汤”浓缩液，按5g/kg体重计算，每只约1ml/天；西药组灌西药盐酸氟西汀（百优解）混悬液，按4mg/kg体重计算，每只约1ml/天；模型组灌0．9%生理盐水，按4ml/kg体重计算，每只约1ml/天。空白组不进行任何干预。实验时间为21天。

1．5 造模方法：参照Willner等[2]的方法，并加以改进，采用孤养抑郁模型与慢性轻度不可预见性应激抑郁模型相结合制作实验性抑郁动物模型。空白组大鼠分两笼，5只/笼群养，自然光照，自由饮食。中、西药物组与模型组大鼠施行孤养，1只/笼饲养，分别接受21天各种不同的慢性轻度不可预见的应激刺激，包括①电击足底，36V交流电，电流强度1．0mA，每隔1分钟刺激1次，每次持续10秒，共30次；②冰水游泳，4℃冰水，5分钟；③潮湿垫料，在需要刺激的动物笼中分别加入100～300ml水，使笼中所垫纸屑足够潮湿，每次24小时；④夹尾，用书夹夹住大鼠尾巴后1/3大鼠比较敏感的部位，每次1分钟；⑤禁水24小时；⑥禁食24小时；⑦昼夜颠倒，保持昼夜颠倒各12小时等应激刺激。以上刺激每日1种，同种刺激随机分配，但不能连续出现，并且每种刺激在每一轮出现的次序不能相同，使动物不能预料到下一种刺激的发生。每天在灌胃结束半小时后进行刺激。

1．6 取材及NOS、SOD、MDA测定方法：造模结束后，次日上午8时称取体重后，3%戊巴比妥钠(100mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，解剖大鼠，冰上打开颅腔取大脑组织约500mg，在4℃冰冷生理盐水中漂洗，滤纸吸干，称重，再加入生理盐水，用实验室高剪分散乳化机匀浆，制备成10％的组织匀浆，4℃低温离心机5000转/min,离心10min，用枪头取上清置于4℃冰箱中保存，用考马斯亮蓝法测定脑蛋白含量，采用硝酸还原酶法检测NOS活性、黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性和TBA比色法检测MDA含量。

1．7 统计学方法：SPSS12．0统计软件包，采用完全随机设计资料单因素方差分析进行统计分析,组间差异采用LSD检验，P

2 结果

实验结果见表1。从表1可见，模型组脑内NOS活性明显高于空白组、中药组和西药组，有显著性差异（P0．05）。中药组脑内MDA含量明显低于西药组和模型组，有显著性差异（P0．05），西药组和模型组之间也无显著性差异（P>0．05）；各组大鼠脑SOD活性无显著性差异（P>0．05）。

3 讨论

目前认为，长期不良处境及生活事件是一种慢性应激，是诱发抑郁症的主要原因。慢性轻度不可预见性应激(CUMS)抑郁动物模型就是根据此理论依据建立，其可模拟抑郁的核心症状,已被国内外学者广泛采用,用以探讨抑郁症发病机制和抗抑郁药物作用的研究[3]。以往研究表明，正常生理状况下,NO在突触可塑性、神经内分泌、神经传导等多种生理功能中发挥重要作用，但是，当NO异常表达时也会产生明显的神经毒性作用[4]，而脑内分布的NOS过度激活后导致大量NO和超氧阴离子产生被认为是造出脑组织氧化损伤的重要因素。本研究发现，当动物处于慢性轻度不可预见性应激条件下时，脑组织中的NOS（一氧化氮合酶）有明显升高的现象，而中医温化痰湿法能够抑制其过度生成。MDA作为难以被清除的脂质过氧化反应最终产物，会对神经元造成损伤。实验中我们发现慢性应激状态下，动物脑组织中MDA水平异常升高。而中医温化痰湿法能明显降低大鼠脑内MDA的含量，作用甚至优于抗抑郁药物百优解。SOD是体内的一种抗氧化酶，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受自由基损伤，对机体氧化和抗氧化系统平衡起着至关重要的作用。在本研究中比较四组大鼠脑组织中SOD活性，虽然中药组有一定的降低，但统计学结果显示无显著性差异（P>0．05），这表明慢性应激状态下脑内自由基的清除机制可能不是通过增加SOD活性来实现的，但具体原因还有待于进一步研究。

痰湿是抑郁症的中医学重要的病理机制之一，情志失和、肝郁犯脾、脾失健运、聚湿生痰，痰湿上扰清阳、蒙蔽心窍，则会出现精神抑郁、对生活无兴趣、精力减退、惶恐不安、心烦呕恶、夜不能寐、纳差，舌苔白腻或黄厚，脉弦滑等症状。十味温胆汤作为经典的温化痰湿方剂，具有益气养心，安神宁志，祛痰利气，条达气机的功效。从现代药理学机制来看，方中人参对高级神经系统兴奋与抑制均有增强作用，能调节大脑皮质功能紊乱使其恢复正常，提高大脑的机能，清除体内致衰老的自由基的作用；酸枣仁中的阿魏酸成分亦有抗氧化和消除自由基；而半夏中的β-谷甾醇对氧自由基具有较强的抗氧化作用。有实验证明，五味子对活性氧应激状态下的细胞具有保护作用[5]；远志则可通过提高体内抗氧化能力,清除生成的自由基,抑制或减轻了机体组织和细胞的过氧化过程[6]。结合本实验结果及中药的现代药理学研究，作者认为慢性应激引起大脑内NOS大量表达，导致氧化应激的中间代谢产物NO、MDA的过量生成，可能是慢性应激引起脑损伤性改变，最终诱发抑郁症的生化机制之一。而十味温胆汤由于可以抑制慢性应激引起的脑内NOS活性的增加，清除脂质氧化产物MDA，保护神经元，从而实现其抗抑郁的作用。但中药复方的作用机制是多元性的，其余机制尚待于今后作进一步的深入研究。

4 参考文献

［1］Herken H,Gurel A,Selek S,et al. Adenosine deaminase, nitric oxide, superoxide dismutase, and xanthine oxidase in patients with major depression: impact of antidepressant treatment［J］. Arch Med,2007,38(2):247-252.

［2］Willner P, Towell A, Sampson D,et al. Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable stress and its restoration by a tricyclic antidepressant ［J］.Psychopharmacology,1987,93：358-364.

［3］李晓秋，许晶.抑郁动物模型的研究进展［J］.中华精神科杂志，2002，35（3）：184-186.

［4］Mishra OP,Delivoria-Papadopoulos M. Nitric oxide-mediated Ca2+-influx in neuromal nuclei and cortical synaptosomes of normoxic and hupoxic newborn piglets ［J］. Neurosci Lett, 2002, 318 (2) : 93-97.

［5］黄诒森，何燕，张均田．五味子三种成分的抗氧化作用［J］.中国药理学与毒理学杂志,1990,4(4):275-277.

［6］李光植,黄瑛,王琳.远志对D-半乳糖致衰小鼠红细胞中超氧化物歧化酶、肝组织谷胱甘肽过氧化物酶活性影响的实验研究［J］.黑龙江医药科学,2000,23(1):4-5.

收稿日期 2008-09-11