基质层在暗背景下被衬托的细胞核
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【摘要】目的：用HRTⅡ代/Rostock角膜模块对正常人眼角膜结构进行观察和分析。方法：应用激光共焦显微镜对46例（92眼）正常人的中央角膜，上下方角膜缘进行检查分析。结果：上下方角膜缘可观察到Vogt栅栏状结构，并可动态观察到血细胞在血管内流动。上下方角膜缘表层上皮细胞密度低于中央表层上皮细胞（P<0.05）。Langerhans细胞（Lcs）位于角膜35~60μm处，其形态表现为细胞核较大且树枝状突起较多或者核较小且突起较少，可能分别代表Lcs处于成熟和未成熟状态。Lcs平均密度角膜缘明显高于角膜中央，角膜中央Lcs不可计数。正常人角膜上皮基底细胞下层神经排列较规则，平行走行，深层神经纤维较浅层神经纤维粗大，弯曲度小，少见分支，纤维之间的交联很少，神经串珠清晰可见。角膜中央前基质细胞与后基质细胞平均密度相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。角膜中央厚度为551±39μm。结论：激光共焦显微镜能在三维空间、实时、活体条件下对角膜组织进行无损伤的光学断层扫描成像，观察角膜各层细胞、神经及胶原等形态结构，并可研究其动态变化，具有广阔的应用前景。
【关键词】角膜Langerhans细胞激光共焦显微镜
海德堡视网膜断层扫描系统Ⅱ代（HRTⅡ）是利用共聚焦激光的原理获取和定量分析眼后节三维形态的仪器，通过增加Rostock角膜模块组（RCM），HRTⅡ可以转变成共焦激光角膜显微镜，用来获取和分析角膜各层面二维图像和整个角膜的三维图像。我们应用HRTⅡ代/RCM检查了92个正常人角膜，为进一步研究各种角膜疾病提供参考，现报告如下。
1对象和方法
1.1研究对象46例受检者（92眼）来自2006年10月~2007年2月在南通大学附属医院眼科接受屈光手术术前检查及常规体检者，其中男20例，女26例，年龄20~61岁，平均38.3±10.9岁。所有受检眼均无外伤、感染及配戴接触镜史，经裂隙灯显微镜检查角膜透明，检眼镜检查无异常。作为正常健康眼入选本研究。
1.2激光共焦显微镜检查表面麻醉后滴50ulVidisic眼凝胶(美国博士伦公司生产)于物镜头表面，盖上一次性无菌角膜接触帽；移动固视灯令其向下看，在CCD摄取的监控图像的指导下，调整物镜位置直至激光光束位于上方角膜缘中央；前移物镜至接触帽与之轻微接触，预设置两者接触的焦平面深度为0μm；转动焦平面调节环以获得角膜不同深度不同层次的图像；根据所获图像的真实焦平面位置(深度用μm数表示)进行调整；移动固视灯改变被检者注视方向，检查上方角膜缘，中央角膜及结膜细胞；选择有价值的图像与录像存盘。
1.3图像分析与统计参数利用HRTII/RCM软件分析系统，计算角膜各层细胞的平均密度。其中将角膜上皮分为3层：表层上皮细胞层、翼状上皮细胞层（角膜基底上皮细胞层之前30μm处）和基底上皮细胞层，分别计算中央角膜及上下方角膜缘表层上皮细胞层，中央角膜翼状上皮细胞层，基底上皮细胞层的细胞平均密度；将角膜基质层分为两段，计算前基质层（近Bowman膜基质层），后基质层（近Descemet膜最后一层基质层）扫描图像的细胞密度；分析角膜上皮基底细胞层下的神经，1幅图像内所有神经纤维分支的总数量为神经数量(支／幅)；计算上下方角膜缘Langerhans细胞及中央角膜内皮细胞的平均密度；角膜厚度是指角膜接触帽到内皮细胞之间的距离（μm）。
1.4统计学方法用Rostock操作软件进行细胞计数，数据统计用x±s表示，每两组细胞平均密度数值之间统计学差异应用配对t检验，以P<0.05作为差异有统计学意义。
2结果
共焦显微镜检查的92眼中，获得角膜中央上皮表层细胞图像20眼（21.7％），获得角膜缘表层上皮细胞图像29眼（31.5％），获得角膜缘Langerhans细胞图像59眼（64.1％），获得角膜中央Langerhans细胞图像28眼（30.4％），获得角膜上皮翼状细胞层、基底细胞层、前基质层和后基质层图像92眼(1O0.0％)，获得内皮图像90眼(97.8％)，对所有图像进行形态学和细胞密度分析如下。
2.1上皮层正常的表层上皮细胞排列疏松，边界清晰，呈多角形，以六边形为主，胞核明亮。角膜中央表层上皮细胞平均密度为1124±290个/mm2，上下方角膜缘表层上皮细胞平均密度分别为847±302个/mm2和803±293个/mm2。上下方角膜缘表层上皮细胞密度相比较差异无统计学意义（t=0.98，P>0.05)，但低于中央表层上皮细胞（t=12.61，P<0.05）。翼状细胞呈多角形，细胞向侧面延伸变细，形似翼状，边界清晰，胞核反光较弱。角膜中央翼状细胞层细胞平均密度为4279±270个/mm2。基底细胞近似圆形，排列紧密，边界明亮，胞质和胞核反光弱。角膜中央基底细胞平均密度为6513±422个/mm2。
2.2角膜缘Vogt栅栏状结构和Langerhans细胞用共焦显微镜可观察到角膜缘Vogt栅栏状结构：角膜缘上皮细胞层数增多向深层增生形成上皮柱，上皮柱之间的结缔组织向上突起形成指状突起，上皮柱和指状突起有规律地交替排列。动态观察到血细胞在血管内的流动。Langerhans细胞（Lcs）位于角膜35~60μm处，绝大多数Lcs位于基底上皮细胞层和前弹力层，少量Lcs位于翼状上皮细胞层深部。其形态表现为细胞核较大且树枝状突起较多或者核较小且突起较少，可能分别代表Lcs处于成熟和未成熟状态[1]。上方和下方角膜缘Lcs平均密度分别为184±25个/mm2，175±23个/mm2。两者比较差异无统计学意义(t=1.15，P>0.05)。Lcs平均密度角膜缘明显高于角膜中央，角膜中央Lcs不可计数。
2.3中央角膜上皮基底层下神经纤维Bowman膜在共焦显微镜下无形态及结构。正常人角膜上皮基底细胞下层神经排列比较规则，平行走行，浅层神经纤维弯曲度较大，神经纤维分支较多，深层神经纤维粗大，弯曲度小，少见分支，纤维之间的交联很少，神经串珠清晰可见。中央角膜上皮基底层下神经纤维的数量为8.4±1.4支/幅。观察视野为380μm×380μm。神经纤维丛旁边偶见明亮的Langerhans细胞，细胞密度不可计数，形态不规则。
2.4基质层在图像的暗背景下被衬托出发亮的细胞核，核间有不定形的黑色背景分割。细胞核形态为成骨细胞状、纺锤状及椭圆形，窥不清细胞胞浆、细胞边缘及板层胶原。基质细胞的密度以Bowman膜下的最高。角膜中央前基质细胞平均密度为1130±96个/mm2，后基质细胞平均密度为778±53个/mm2。两者之间细胞密度差异有统计学意义（t=10.89,P<0.05）。另外，在前中基质层可见粗大的分支状的神经干。
2.5内皮细胞层及角膜厚度角膜内皮细胞(图9)呈六边形，细胞边界呈黑色，胞体明亮，看不到胞核。与角膜内皮镜检查时的细胞形态相同，细胞密度越大者，六边形形态规则占的比例越大；反之，细胞六边形越少，不规则形细胞比例增大。角膜中央内皮细胞平均密度为3128±324个/mm2。角膜中央厚度为551±39μm。