血管内皮生长因子和雌二醇促进血管内皮祖细胞分化生成血管的对比研究
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[摘要]目的：对比研究常规剂量下血管内皮生长因子（VEGF）和雌二醇对血管内皮祖细胞（EPCs）分化生成血管的促进作用。方法：分离培养人外周血EPCs，与基质胶混匀后注射到9只裸鼠双侧下腹部，另设2只注射等体积培养液与基质胶的混合液。将9只注射细胞的裸鼠随机分为3组，每组分别定期局部注射VEGF、雌二醇，生理盐水，定期观察记录血管组织块的生长状况。移植6周后取材，测量计算血管组织块的体积、HE染色观察血管组织块的血管增殖状况，各组之间进行对比。结果：给药组血管组织块体积与注射生理盐水组相比，具有显著性差异，体积明显偏大，而给药组之间体积未见显著性差异。HE染色观察可见各组的血管组织块内血管增殖明显，血管排列紊乱的，管腔大小不一。给药组血管密度明显大于注射生理盐水组，而给药组之间的血管密度差异较小。结论：VEGF和雌二醇组具有促进EPCs分裂增殖形成血管的能力，常规剂量下两者促进EPCs分裂增殖生成血管的能力无显著性差异。
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）01-0048-03
Comparative study of vascular endothelial growth factor and estradiol in promoting endothelial progenitor cells differentiation and generation blood vessels
DONG Yong，LI Wen-zhi，XIN Yi，SUN Zhi
（Department of Plastic Surgery and Laser Medicine，Beijing Anzhen Hospital of Capital Medical University Beijing Institute of Cardiopulmonary and Vascular Disease，Beijing 100029，China）
Abstract： Objective To compare the ability of vascular endothelial growth factor （VEGF） and estradiol in promoting endothelial progenitor cells differentiation and generation blood vessels under common doses. Methods To isolate and culture human peripheral blood EPCs first， then to mixe with the matrigel and transplante to the lower abdomens of nine nude mice，to divide the nine nude mice into three groups according to a random grouping， to inject VEGF，estradiol and saline at a regular time，to observe and record the growing status of vascular tissue regularly，to draw the vascular tissue after six weeks，to observe the organizational structure by HE staining， then contrast with the groups. Results The vascular tissue volume groups injected of drugs have significant difference with the groups injected of saline，they have bigger volume to contrast the groups injected of saline， but he vascular tissue volume between the groups injected of drugs is no significant difference. By drawning HE staining， the vascular tissues have proliferational mussy blood vessels，The vascular density of the groups injected of drugs is significantly greater than the groups injected of saline， but he vascular density between the groups injected of drugs is small. Conclusion VEGF and estradiol can promote EPCs differentiation and generation blood vessels，their respective promoting EPCs differentiation and generation blood vessels potency is no significant difference under common doses.
Key words：endothelial progenitor cells； blood vessel；vascular endothelial growth factor；estradiol
血管内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，EPCs因参与血管的再内皮化和血管新生，在心脑血管疾病治疗及创伤修复等方面发挥着重要的作用，已经有大量的研究通过移植EPCs治疗缺血性和创伤性疾病，取得了很好的疗效[1-3]。VEGF和雌二醇通过加强EPCs的迁移增殖和粘附，具有促进血管生成的作用，但两种药物用于促进EPCs分化生成血管的研究报道较少，而有关两者在常规剂量下促进血管生成效果方面的对比研究还未见报道，本研究通过移植EPCs至裸鼠，通过比较EPCs增殖生成血管组织块的体积和血管组织块内血管的密度来比较两种药物的效果，为今后两种的药物的合理应用提供实验数据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物：Balb/ca-nu裸鼠（购自北京大学动物实验中心）。
1.1.2 主要试剂和仪器：EGM-2培养基 （Lonza公司），人淋巴细胞分离液（天津灝洋生物制品有限公司），基质胶（BD公司），雌二醇（Sigama公司），VEGF（Sigama公司），鼠抗人CD133单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），VEGFR-2（北京博奥森生物技术有限公司），鼠抗人CD34单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），Ⅷ因子（北京中杉金桥生物技术有限公司），鼠兔通用型二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），多聚赖氨酸（Sigama公司），多聚甲醛（Sigama公司），浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），Olympus倒置显微镜（日本）。
1.2 方法
1.2.1 EPCs的分离、培养、扩增和鉴定：每次采集健康人外周血25mL，肝素抗凝后用 磷酸盐缓冲液（pbs）稀释（1：1），稀释后沿试管壁缓慢加入到人淋巴细胞分离液液面上（血液与Ficoll体积比为2：3），然后将其放到水平离心机内以2000 r/min速度离心20 min。离心后液体从上到下被分为四层，依次为血浆层，单个核细胞层，淋巴细胞分离液层，红细胞层。吸取单个核细胞层后加入等体积含有2%胎牛血清的pbs，以1000 r/min速度离心10min，弃上清液，离心两遍，清洗两遍。细胞培养至第7天后用PBS洗掉非贴壁细胞，留下的贴壁细胞用胰酶消化，消化完成后加完全培养基终止，吸取细胞液以1000r/min速度离心10min。将离心后的细胞加培养基混匀，然后滴加到培养皿内的细胞爬片上，让细胞贴片30min后，在培养皿内轻轻的添加完全培养液，放于温度为370C、二氧化碳体积分数为5%和湿度≥95%培养箱中培养至细胞爬满爬片。
1.2.2 移植血管内皮祖细胞：取2～3代贴壁细胞用PBS洗涤2次，胰酶消化后浓集制成细胞悬液，使其密度为1×106/ml。选用Balb/ca-nu裸鼠11只，雌雄不限，鼠龄（30±3） 天，体重（18±2）g ，随机选取9只裸鼠分为A、B、C三组，取细胞悬液与等量基质胶混匀后植入裸鼠腹部双侧皮下组织内，每处约0.5ml，共18处。每周给予A组VEGF 150ng/只、B组雌二醇0.1mg/只，C组生理盐水0.5ml。剩余2只裸鼠仅注射0.5ml培养液与基质胶的混合液。
1.2.3 培养组织的观察：每周定期观察记录血管组织块的生长情况，测量血管组织块长径a和短径b，按公式v=ab2/2计算组织块体积。移植后第六周时切取组织，用4%多聚甲醛固定，所有的样本浸入石蜡，制成石蜡切片后作HE染色，对比观察血管组织块及周边皮肤组织的光镜结构。
2 结果
1周后观察两只仅注射培养液与基质胶混合液的裸鼠发现注射部位凸起的肿块变小，两周后几乎消失。9只注射细胞裸鼠的血管组织块生长迅速，体积明显增大，外形呈球状，触之较软（图1）。六周后取材，对A组、B组与C组的血管组织块体积分别进行多样本方差分析（表1），结果A组（0.61±0.05）cm3、B组（0.57±0.04）cm3与C组（0.3±0.01）cm3相比都具有显著性差异，体积明显偏大（图2），A组与B组的体积对比未见显著性差异。进行HE染色观察，注射细胞组裸鼠与仅注射培养液与基质胶混合液的裸鼠相比，新生组织内血管增殖明显，许多蓝染的血管内皮细胞围成管腔样结构，管腔排列紊乱，大小不一。A组和B组血管组织块的血管密度与C组相比明显偏大，而A组和B组之间的差异较小（图3）。
3 讨论
血管新生是从先前存在的血管上出芽生成新生毛细血管的过程，人体组织的正常生长均需要血管新生。血管发生指发生在胚胎发育时期的EPCs形成原始血管的过程。近年来的研究发现，骨髓和循环外周血中也存在EPCs[4]，EPCs不仅参与血管发生，在缺血、创伤等因素下，骨髓EPCs还可定向迁移至缺血部位，增殖分化为血管内皮细胞参与血管新生。VEGF和雌二醇对EPCs的增殖、分化和迁移起着重要的调节作用，运用其调节后，不但会促进EPCs分化生成血管，而且势必会减少EPCs的用量。尽管已有研究表明VEGF和雌二醇对EPCs的分化都起着较强的促进作用，但是目前还未见有关两者间效果比较的研究报道。
本研究利用EPCs分化增殖生成血管的特点，将相同剂量的EPCs移植到裸鼠皮下，定期注射常规剂量的VEGF（150ng）和雌二醇（0.1mg），通过血管组织块的体积和血管组织块内血管密度来间接反映它们对EPCs分化生成血管的促进作用。结果显示给药组血管组织块的体积与血管密度与单纯注射盐水组相比都明显的偏大，提示VEGF和雌二醇对EPCs的分化具有较强的促进作用，而常规剂量下VEGF和雌二醇促进EPCs分化生成血管的作用却无明显的差异。
VEGF和雌二醇与EPCs的生物活性密切相关。VEGF又称血管通透因子，是一种特异性的，与血管生长有密切关系，并有促进血管通透性作用的细胞因子。VEGF通过和内皮细胞表面特异性受体结合，向细胞内传递血管生成信号[5]，VEGF不仅能够促进EPCs的动员、增殖[6]，并对EPCs具有趋化作用， 可促进血管内膜修复及缺血组织的血管新生[7]。雌二醇与血管系统的形成和功能密切相关[8]，雌二醇能增强血管内皮细胞的增殖、迁移和形成，雌二醇介导的内皮功能的改善与其能够促进其前体EPCs的增殖、迁移与黏附[9]有很大的关系。研究表明雌二醇能通过内皮型一氧化氮合酶相关的机制动员骨髓来源的 EPCs到达外周血，促进血管新生和内皮损伤后的修复过程[10]，此外，雌二醇还可以通过促进端粒酶活性来抑制 EPCs 衰老，促进 EPCs 的分化[11-13]。
VEGF是目前最强效的促血管生成因子， 一般认为，在常规剂量下，VEGF促进EPCs分化生成血管的能力要强于雌二醇，但在研究中我们发现，两者在注射给药方式下促进EPCs分裂增殖生成血管的能力却无显著性差异，这可能是由于VEGF生物半衰其短，直接注射给药后，难以在体内维持持续的有效浓度。虽然雌二醇的最大药效与VEGF相比较弱，但其生物半衰期相对较长，注射后有效药物浓度维持时间也较长，因此雌二醇的实际药物效应与VEGF相比未见显著性差异。
在血管性疾病的研究中，VEGF常被用来促进血管的生成，但VEGF提取困难，价格昂贵，而且通常采用的注射给药方法很难实现药效的合理发挥，因此若采用雌二醇来代替VEGF，在取得相同效果的同时，将会大大节约试验成本。
综上所述，本研究率先对常规剂量下VEGF和雌二醇促进EPCs分裂增殖生成血管的能力进行了对比研究，该项研究不但验证了VEGF和雌二醇具有促进EPCs分化生成血管的能力，而且结果提示两者之间对EPCs分化生成血管的能力无显著差异。这不但指正出了人们在利用VEGF时的误区，而且该研究也为人们在血管性疾病研究中合理选取促血管生成药物时提供了参考数据。
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