硫酸铜对小鼠脾细胞DNA损伤研究

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摘要： ［目的］ 观察不同剂量硫酸铜作用不同时间对小鼠脾细胞dna链断裂损伤的影响。 ［方法］ 采用单细胞凝胶电泳法（SCGE）分别测定小鼠灌胃1次染毒硫酸铜50、100、200 mg/kg和连续每天1次灌胃硫酸铜12.5、25.0和50.0 mg/kg 2周及连续灌胃3、6和12 mg/kg 1个月后小鼠脾细胞DNA 链断裂损伤情况。各染毒组均没相应的对照组。 ［结果］ 50、100和200 mg/kg硫酸铜1次染毒；25.0和50.0 mg/kg硫酸铜染毒2周；6和12 mg/kg硫酸铜染毒1个月后，脾细胞均出现DNA链断裂损伤的频率以及尾长均明显高于对照组。 ［结论］ 硫酸铜可引起脾脏细胞明显的DNA链断裂损伤，此损伤作用存在蓄积效应。

关键词：硫酸铜；脾细胞；DNA 链断裂

文章编号:1006-3617(2007)01-0080-03

中图分类号:R114

文献标识码:A

铜广泛存在于土壤和水中，其生物学作用具有双向性。一方面它是人类和动物的必需元素，为了维持机体的健康状态，体内需要维持一定水平的铜，如果机体出现铜缺乏，可能会出现多种损害；对于免疫系统而言，铜对于其某些组织的发育及免疫应答过程是必备的；另一方面，如果体内铜的水平超过一定的限度，也会产生毒性作用。铜盐的使用非常广泛，在工业方面可作为重要的化工原料、催化剂；在农业和养殖业，作为消毒剂使用；日常生活中也经常遇到用铜盐消毒的情况。此外，由于在各种仪器的装置中大量使用铜，这就不可避免的会进入人类的生活环境［1~3］。既往对铜过量毒性的研究主要关注在对肝脏和肾脏的损伤作用，较低剂量的铜即可引起明显的胃肠道黏膜刺激症状，其中恶心和呕吐是发生最早和频率最高的症状，在较高剂量时甚至引起溶血性贫血、肝衰竭、肾衰竭、休克、昏迷或死亡［4 ，5］。此外还有研究表明，铜具有致癌性和致畸性，但是研究结果并不一致［6］。本研究组已有的研究结果显示，100和200 mg/kg硫酸铜一次灌胃染毒对小鼠的B淋巴细胞增值能力产生抑制；200 mg/kg硫酸铜抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力；50、100和200 mg/kg硫酸铜染毒后24 h均能抑制小鼠NK细胞的杀伤活性。相关的研究还发现铜可以增加小鼠相关组织中的羟自由基增加，自由基以及氧化损伤会导致细胞的DNA链断裂损伤。本研究观察了在铜引起免疫功能抑制的剂量下，是否可引起免疫细胞的DNA链断裂损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级BALB/c小鼠，雌性，6周龄，体重22～24 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有动物均食用由中国医学科学院实验动物部提供的饲料，自由饮水、进食。

1.2 染毒方式及剂量 将小鼠随机分组，每组5只，以灌胃的方式给小鼠染毒硫酸铜分以下各组：一次染毒的0、50、100和200 mg/ kg；1d1次分别染毒0、12.5、25.0和50.0 mg/ kg连续2周和0、3、6和12 mg/ kg连续1个月。均在最后1次染毒后24 h处死。

1.3 脾脏单细胞悬液的制备 将小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，剥去结缔组织，置于盛有Hanks 液的平皿中，用塑料针芯将脾脏在200目的不锈钢网中轻轻研磨，即成单细胞悬液。

1.4 单细胞凝胶电泳 将单细胞悬液与等量1 %低熔点琼脂糖混合，包埋在磨沙载玻片上，制成凝胶板，再将胶板裂解、解旋、电泳、中和，最后用碘化丙啶染色。在荧光显微镜下，使用590 nm的绿色激发光进行观察。记录每100个细胞中出现的彗星细胞数以及彗星细胞的尾长。

1.5 数据处理及统计分析 对DNA 链断裂损伤指标采用SPSS分析软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 不同剂量硫酸铜一次性染毒脾细胞DNA 链断裂损伤情况

在硫酸铜一次性灌胃染毒24 h后，高、中、低剂量组的小鼠脾脏细胞出现DNA链断裂损伤的细胞频率及尾长与对照组相比明显升高（P < 0.05），而且随染毒剂量的增加损伤进一步加重，表现出明显的剂量-反应关系 （表1） 。

2.2 不同剂量硫酸铜连续染毒2周后脾细胞DNA 链断裂损伤情况

25和50 mg/kg硫酸铜连续灌胃染毒2周后脾脏细胞出现DNA链断裂损伤明显加重，无论是损伤细胞频率还是尾长与对照组相比差异均有显著性（P

2.3 不同剂量硫酸铜连续染毒1个月后脾细胞DNA 链断裂损伤情况

6和12 mg/kg硫酸铜连续灌胃染毒1个月后脾脏细胞出现明显的DNA链断裂损伤，损伤细胞频率及尾长与对照组相比均明显升高（P < 0.01）。3 mg/kg组与对照组比较未显示明显差异（表3）。

3 讨论

本研究结果显示，硫酸铜一次灌胃染毒24 h后，在脾细胞可以观察到明显的DNA链断裂损伤，所观察的3个剂量50、100和200 mg/kg硫酸铜均具有明显的诱导DNA链断裂效应，无论是损伤细胞的频率还是细胞的损伤程度均随染毒剂量的增加而加重；在延长染毒期限和降低染毒剂量以后，发现50 mg/kg硫酸铜连续染毒2周脾细胞的DNA链断裂损伤比同剂量一次染毒更严重，25 mg/kg硫酸铜连续染毒2周也引发了脾细胞明显的DNA链断裂损伤；进一步的硫酸铜连续染毒1个月时6和12 mg/kg硫酸铜处理组小鼠同样出现明显的DNA链断裂损伤。大量体外试验结果表明铜暴露可引起多种组织细胞内活性氧产生增加，铜离子参与ROS的形成，当超氧阴离子或者GSH存在的情况下，Cu2+会变成Cu+，而Cu+又会和H2O2反应形成羟自由基［7，8］，由此可能引发一系列的损伤，包括DNA链断裂损伤。本研究中随着染毒时间延长，引起DNA链断裂效应的剂量也逐渐降低，可能是由于蓄积效应所致。既往的研究也发现，饲料中铜过量会引起大鼠在肝脏出现铜蓄积，同时肝细胞出现DNA 链断裂损伤［9，10］。

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