RP-HPLC法测定黄芩苷和黄芩素的含量
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摘要：目的用反向高效液相（rp-hplc）法测定滇黄芩和黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量。方法乙腈（含1.0 %甲酸）-1.0 %甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长274 nm，柱温30 ℃。结果在精密度，重现性，稳定性实验中，保留时间和峰面积的RSD均小于2%；加标回收率分别为100.7%和100.5%，RSD为1.78% 和1.85 %；黄芩苷在0.102~2.04μg之间，黄芩素在0.72~14.40 μg之间呈良好的线性关系，r=0.999 9。结论此实验方法简便、准确、重复性好。
关键词：黄芩苷；黄芩素；反相高效液相；含量测定
中图分类号：O657.7+2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)03-0015-03
Determination of Baicalin and Baicalein by RP- HPLC
XIONG Chun-mei1, GUO Ya-dong1*, MA Yin-hai2, LIAO Yu1, ZHANG Ping1
(1.School of Pharmacy, Kunming Medical College, Kunming 650031,China；2. Department of Chemistry, Kunming Normal College, Kunming 650031, China)
Abstract：Objective To establish a RP-HPLC method for the determination of the contents of baicalin and baicalein in Scutellariae. Methods Zorbax 250 mm×4.6 mm i.d.5.0 μm column was used with a mixture liquid of acetonitrile (containing 1.0 % formic acid)- 1.0 % formic acid as mobile phase in gradient elution. The column temperature was controlled at 30℃, the detection wavelength was 274 nm. Results In the experiments of precision, reproducibility and stability, the samples could be separated entirely. The average recoveries of the baicalin and baicalein were respectively 100.7% and 100.5% with RSD of 1.78% and 1.85%. The linear ranges were 0.102~ 2.04 μg (r=0.999 9) for baicalin and 0.72~14.40 μg (r=0.999 9) for baicalein. Conclusion This method is simple, accurate and has a good reproducibility for the determination of the contents of baicalin and baicalein in Scutellariae.
Key words：baicalin; baicalein; RP-HPLC; assay
黄芩是常用中药，《中华人民共和国药典》（一部）收录的黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi ）的干燥根[1]，市场流通的商品黄芩除来自野生的和栽培的黄芩之外，有些地方还将根断面为黄色的黄芩属（Scutellaria）的多种植物作黄芩药用，主要有黏毛黄芩（S.viscidula Bunge）、和滇黄芩（S.amoena C.H.Wright）等。滇黄芩是西南地区药用黄芩的主流品种，分布于云南、贵州等省，资源丰富，最早记载于《滇南本草》。黄芩苷和黄芩素具有多种药理活性，在药物中的应用广泛，用量大[2]。用HPLC法测定黄芩中黄芩苷的含量多有报道[3-6]，本实验用RP-HPLC法对云南8处产的滇黄芩与《中华人民共和国药典》收录的黄芩中的黄芩苷和黄芩素含量进行测定比较，结果表明，滇黄芩饮片与其他黄芩饮片中有效成分的含量差别不明显。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国）； 黄芩苷、黄芩素对照品（中国药品生物制品检定所）；滇黄芩及黄芩的干燥根（云南白药集团天紫红药业提供并鉴定）；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1色谱条件和系统适应性实验
C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），检测波长274 nm，柱温30℃，流动相A为含1.0%甲酸的乙腈溶液、B为1.0%甲酸溶液，线性梯度洗脱见表1。流速1.0 mL/min，进样量10μL，黄芩苷对照品的平均理论塔板数为120 364。
表1流动相线性梯度洗脱表
2.2供试品溶液和对照品溶液的制备
精密称取药材粉末0.5 g置于100 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇50 mL，回流3 h，放冷，过滤至100 mL量瓶中，用少量的70%乙醇反复洗涤瓶壁和残渣，合并滤液，定容至刻度，取1.00 mL续滤液于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
精密称取黄芩苷、黄芩素对照品适量，分别用甲醇制成含黄芩苷0.102 mg/mL，黄芩素0.72 mg/mL的对照品溶液。
2.3线性关系考察
取上述对照品溶液1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0μL，注入液相色谱仪。记录色谱峰面积，以黄芩苷和黄芩素的进样量（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标进行回归分析，得回归方程分别为：
y1=2 717.27x1－21.20，r1=0.999 9 （黄芩苷）
y2=207.43x2+0.90，r2=0.999 9（黄芩素）
由以上方程可见，黄芩苷在0.102 ~2.04 μg之间，黄芩素在0.72~14.40μg之间呈良好的线性关系，黄芩苷和黄芩素的最低检测限分别为0.026 μg和0.18μg (S/N=3)。
2.4精密度实验
分别取黄芩苷、黄芩素对照品溶液，连续进样6次，记录色谱峰面积，黄芩苷和黄芩素峰面积的RSD分别为1.97%和1.23%。
2.5重复性实验
取1号滇黄芩根粉末6份，精密称定，按2.2方法制备供试品溶液并测定，黄芩苷和黄芩素峰面积的RSD分别为2.91%和2.83%。
2.6稳定性实验
取1号滇黄芩供试品溶液，分别在0，6，12，24，36，48 h测定，结果表明，供试品溶液在48 h内稳定，黄芩苷峰面积的RSD为2.04 %，黄芩素峰面积的RSD为1.85%。
2.7回收率实验
精密称取已知含量的供试品5份，分别加入一定量的黄芩苷和黄芩素对照品，按供试品的制备和测定方法操作。计算其加样回收率，结果见表2和表3。
表 2黄芩苷加样回收率实验
表 3黄芩素加样回收率实验
3 黄芩苷和黄芩素的含量测定
按供试品制备和测定方法操作，各产地的滇黄芩和黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量测定结果见表4和表5。由表4，5可见，黄芩中的黄芩苷和黄芩素的含量比滇黄芩的稍高些。图1为滇黄芩和黄芩的RP-HPLC色谱图。
表 4 滇黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量测定结果
表 5黄芩中黄芩苷和黄芩素的含量测定结果
t /min
1. 黄芩苷（tR=39.3 min）2. 黄芩素（tR=85.4 min）
图 1滇黄芩和黄芩HPLC图谱
4讨论
黄芩中含有丰富的黄酮类化合物，极性较大，我们考察了几种流动相，用乙腈-水-甲酸为流动相时，色谱峰对称性好，分离度和理论塔板数较高。
黄芩苷和黄芩素应用非常广泛。滇黄芩作为地方习用药材，应进行具体研究。优者保留或进一步发展；劣者淘汰，既有利于充分利用资源，又不会影响中药的质量。本实验测定此类药材中黄芩苷和黄芩素的含量，结果表明差异不大，《中华人民共和国药典》规定黄芩苷含量不得小于9%，本实验所测定的16份样品中，黄芩苷的含量均达到此标准。
参考文献
[1]中华人民共和国国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：化学工业出版社，2005：211-212.
[2]陈秀清，齐香君，何恩铭. 中药黄芩的研究进展[J]. 食品与药品，2006，8（5）：23-26.
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[4]苏健，向东，张华，等. HPLC 测定滇黄芩中黄芩苷的含量[J]. 华西药学杂志，2005，20（4）：356-358.
[5]符洪，肖新月，张南平，等. 药用黄芩中主要化学成分分析[J]. 药物分析杂志，2003，（23）：34-38.
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