原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF表达分析

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【摘 要】本文目的在于对原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190和lif表达进行分析，以了解其对妊娠建立的可能影响。本文成功地建立了血sgp190双抗体夹心ELISA测定法。原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF浓度表达异常，sgp190可能对人体整个循环中LIF表达具有负调节作用，从而影响胚泡着床而造成不孕。

【关键词】白血病抑制因子；可溶性gp190；酶联免疫吸附实验；胚泡着床

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验材料

LIF ELISA检测试剂盒（R&D Systems）、抗gp190胞外区抗体由晶美公司提供。抗sgp190多克隆抗体、sgp190亲和纯化品由本研究室制备[ 1]。

1.1.2研究对象

实验组：17例不明原因原发不孕症患者来源于重庆医科大学附属第一医院，平均年龄28.6士3.7年，不孕年限3～10年，平均3.56士0.89年。

纳入标准：年龄≦35岁，不孕年限>3年，月经周期28～30天，基础体温双相，高温相≥12天，分泌中期血孕酮≥32nmol/L，血PRL正常， 基础内分泌正常，夫妇双方染色体核型正常，抗抗体阴性，宫腔镜检查子宫正常，腹腔镜检查为正常盆腔，子宫、输卵管外观正常，6个月内未用过激素类药物，男方检查正常。

对照组：19例，平均年龄27.7士4.8年，纳入标准：除继往有正常生育史外，其它同实验组。

试验得到受试者知情同意。

1.2 方 法

1.2.1 双抗体夹心sgp190 ELISA检测的建立及方法学鉴定

1.2.1.1 HRP标记抗体的制备：见文献常规方法，用改良碘酸钠法标记亲和层析纯化抗sgp190多克隆抗体。

1.2.1.2双抗体夹心ELISA法的建立与双抗体工作浓度的确定（采用方阵滴定法）

以包被缓冲液稀释抗gp190胞外区部分McAb 至浓度为1、2、4、6μg/ ml，分别在酶标板上进行包被过夜。洗涤3次。在各孔中加入封闭液，37 ℃保温2 h ，洗涤3 次。在各孔中分别加入gp190 抗原液5μg/ ml，37 ℃保温2 h，洗涤3 次。加入系列稀释的酶标抗体兔抗人sgp190（稀释度为1：500-1：3000）100?l，37℃下孵育l h，洗涤5 次。在各孔中加入HRP-羊抗兔IgG抗体，1/ 10000 稀释，100μl/ 孔，37 ℃保温1 h，洗涤6 次。加底物显色。加2mol/ L H2SO4 终止反应后，读取OD450 nm 值。以OD450 nm 值为1 左右的条件作最佳条件，以此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。

1.2.1.3建立标准曲线

以确定浓度的抗人sgp190 McAb包被酶标板，加稀释的标准抗原0.5- 100ng/ml （10 ?g / ml的标准抗原4?l，加396 ?l稀释液成100 ng/ml，然后倍比稀释成0.5- 50ng/ml）。不同浓度的标准品都设四个平行测定孔，37 ℃1 h，洗3 次；加入稀释的兔抗人sgp190抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加入确定稀释度的HRP-羊抗兔IgG抗体100μl / 孔，37 ℃ 1 h，洗3 次；加底物溶液100μl / 孔。37 ℃避光反应10～15 min，2 mol / L H2SO4 终止反应，酶标仪450 nm处读取OD 值。以标准抗原（ ng / ml） 为横坐标，相应OD值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.1.4 检测方法准确性分析（回收实验，Recovery assay）

在已知sgp190 浓度的血浆中加入不同浓度的sgp190标准液，用已建立的ELISA方法测回收率。

1.2.1.5检测方法精确度分析

取3 份血浆标本，做批内和批间测定，计算CV，分析制备sgp190 ELISA检测方法的精确度。

1.2.1.6健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期（月经周期第19～21d）血浆sgp190浓度测定

按上述标准曲线，利用建立的ELISA法测定健康女性与不孕患者植入窗口期血浆中sgp190浓度，每个样本作2个复孔。

1.2.2 健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期（月经周期的第19～21天）血浆LIF浓度测定

LIF ELISA检测试剂盒灵敏度8 pg /ml ，批内CV < 2.5 % 批间CV < 7.1 % ，回收率102%，具体操作步骤按说明书进行。

1.2.3 统计学处理

实验结果用mean±SD表示，用 SPSS 10.0软件进行统计学分析，P

2 结果

2.1 sgp190 ELISA检测酶标抗体与包被抗体最适工作浓度

方阵滴定结果显示，酶标抗体最适稀释度为1：500，包被抗体最适浓度为2?g/ml；在此工作浓度下检测浓缩血清、原倍血清及稀释1/2、1/4的血清样品，发现多数原倍血清的OD值都落在标准曲线之内。故选用原倍血样检测sgp190，如果某些原倍样品的OD值落在标准曲线之外时，改用浓缩血样或稀释血样检测。

2.2 sgp190测定标准曲线

在1.56 - 50ng /ml区间抗原浓度与OD值具有良好线性相关：OD450=0.019106·sgp190+0.288535，r= 0.971325。50ng /ml以上曲线趋饱和，1.563ng/ml以下的 OD值接近空白对照孔，检测灵敏度为1.56ng/ml。根据血样的 OD值，查标准曲线得相应的sgp190浓度。

2.3 sgp190 ELISA检测方法准确性分析

在已知sgp190 浓度的血浆中加入不同浓度的sgp190标准液，用已建立的ELISA方法测得的回收率分别为95%、84% 和87%，平均为88.67% 。

2.4 sgp190 ELISA 检测精确度分析

取3份血浆标本，做批内和批间精确度分析。结果显示，批内平均CV为7.6 %，批间平均CV为12.37 % 。

2.5 LIF与sgp190检测结果

用ELISA方法分别测定健康能育女性与原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF浓度（结果见图2、3），健康对照组（169±27pg/ml）血浆LIF浓度明显高于不孕患者组（123±18pg/ml）（P

3 讨 论

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor， LIF）是一种多功能的细胞因子，在不同的细胞和组织中具有多种生物学活性，近年来发现它在生殖中发挥重要的作用等[2]。LIF启动靶细胞发挥其生物学功能是通过其受体系统实现的。LIF首先与膜受体gp190的胞外区段连接，而后再同gp130（IL-6信号转导子）连接构成异源性二聚体，启动下游信号传导发挥其生物学效应。1998年发现人体液中存在LIF可溶性受体， soluble gp190（sgp190），可能对LIF的活性起抑制作用，但对sgp190具体的生物活性的研究目前尚未见报道。签于LIF在生命活动中重要作用，研究sgp190的生物活性具有非常重要的意义。本研究室制备了sgp190及其多抗，并对其在滋养层细胞侵袭中的作用进行了研究。

ELISA具有操作简便、灵敏度高、特异性好、试剂稳定、结果易判断等忧点，故已成为免疫测定中应用最广泛一项技术。为了便于研究sgp190的生物浓度与生物活性，我们建立了sgp190酶联免疫吸附试验（ELISA）检测法。

直接ELISA法具有操作步骤少、节省时间等优点，但要求待检物的浓度比较高。酶标板对抗原或抗体的吸附性，一般为1-10?g/mL，而实际包被标准抗原的结果显示至少需2?g/mL，方能显示出与空白孔的差异，而正常人血sgp190浓度较低，故难以被吸附。

双抗体夹心 ELSA法的优点是灵敏度高，阴性背景清晰，显色的深浅直接与待测物的含量呈正比，实验结果容易判定。我们成功地建立了血sgp190的双抗体夹心 ELISA测定法。用已建立的ELISA方法测得的回收率， 分别为95%、84% 和87%，平均为88.67% 。 批内CV为7.6 % ，批间CV 12.37 % ， 灵敏度为1.56ng/ml ， 在1.56-50ng /ml区间抗原浓度与OD值具有良好线性相关：OD450=0.019106·sgp190+0.288535，r = 0.971325。表明各项指标可用于本实验的进一步要求。但其稳定性、灵敏度都有待进一步提高。我们分析可能同血样sgp190的降解有关。另外，我们应用的是酶标抗体是多克隆抗体，虽然效价较高（1：10000），且经过纯化，但毕竟存在多个抗原决定簇，可能会与血液中的某些杂蛋白发生交叉反应。所以，在以后的研究中，我们将在尽可能采用两种不同种属动物的单克隆抗体，以提高其灵敏度和特异性、稳定性，为最终建立sgp190检测试剂盒以应用于临床以监测不孕或与LIF相关的疾病诊断提供更加可信的实验依据。

哺乳动物胚胎植入是正常妊娠建立的关键步骤。为了准备植入，伴随激素的升降，子宫经历连续的增殖、分化。在人类，植入开始的标志是腔上皮（LE）的顶层表面与胚泡滋养层细胞开始相互作用。植入始于定位，随后粘附，最后滋养层细胞渗入LE。植入开始于排卵后一个特殊时段，称为“植入窗” ，植入开始前，子宫对胚泡或其他蜕膜化信号无反应。通过对内膜组织形态学研究发现这一时期约为正常月经第19 23 d ，到24d植入基本上完全关闭。

植入主要受激素、粘附分子、细胞因子等的调控，由于整个过程的复杂性，分子机制尚远未明了[5]。尽管许多细胞因子与生长因子被认为在调节植入中起重要作用， 但到目前为止， 只有LIF 显示出在植入中不可缺少的作用。LIF是IL-6家族中成员，在LIF基因敲除小鼠，胚胎发育局限于定位期，而子宫对对胚泡或其他蜕膜化信号无反应，致植入失败 。

一些研究发现：LIF表达减弱或缺失可能与女性不孕有关，具有正常生育能力的女性子宫腔冲洗液中LIF基因在分泌中晚期的子宫内膜腺上皮细胞中大量表达。Laird观察到不明原因不孕女性在LH+10（即黄体晚期）子宫腔冲洗液中LIF浓度较同期正常女性低。我们的实验也得到类似的结果，即不孕患者组血浆LIF浓度明显下降，这或许是引起不孕的原因之一。但什么原因导致不孕患者血浆LIF浓度下降，目前尚无一个确切的解释。

LIF发挥其生物学效应有赖于其受体系统，调节LIF与其相应受体反应可能的分子机制很多，如SOCS1 （the suppressors of cytokine activity ，SOCS）等抑制JAK-STAT路径的激活，从而抑制LIF的效应。我们通过对sgp190生物活性和LIF信号通路中一些相关分子表达变化的研究，发现sgp190参与了调节局部LIF表达变化，可能在胚泡着床、妊娠维持等方面有重要作用（相关结果另文发表）。值得思考的是：LIF异常可导致不孕，那么，sgp190是否会作为机体整体循环中LIF的调节子而参与到胚泡的着床？

我们通过对植入窗口期正常能育妇女与原因不明不育妇女血样LIF与sgp190用ELISA法检测，结果显示，LIF在前者表达高于后者（P< 0.01），sgp190表达则相反（P< 0.05）。表明LIF在哺乳动物胚泡植入中的重要作用，而sgp190可能作为LIF的负调节子，参与LIF调节着床。由于sgp190可结合LIF，我们推测sgp190作用机制是通过结合LIF，使有效或游离LIF浓度降低 ，LIF与gp190结合减少，下游信号活动减弱， 从而影响胚泡着床的进行。