凝胶色谱法测定比阿培南聚合物的含量

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇凝胶色谱法测定比阿培南聚合物的含量范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要] 目的:建立比阿培南聚合物的测定方法。方法:采用葡聚糖凝胶Sephadex G-10不锈钢柱(10 mm×300 mm),流动相A:磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾5.59 g,与磷酸二氢钾0.41 g,加水使其溶解成1 000 ml);流动相B:水;流速为0.3 ml/min;检测波长为254 nm;进样量为200 μl;柱温为室温;对照品采用法罗培南。结果:比阿培南在100.40～400.55 mg/ml 范围内,浓度与聚合物的峰面积呈良好线性关系(r=0.999 9)。结论:凝胶色谱法方法简便,结果可靠,可以用于比阿培南中高分子聚合物杂质的检测。

[关键词] 凝胶色谱法;比阿培南;聚合物

[中图分类号] R927.2[文献标识码]C [文章编号]1674-4721(2010)03(b)-116-02

Determination of high polyler impurities in Biapenem by gel permeation chromatography

MA Jie,ZHAO Yuxin,WANG Guanghui,REN Jiqiu

( Development and Scientific Research Centre,Harbin Pharmaceutical Group CO., LTD. General PharmAceuticalFactory,Heilongjiang Province,Harbin150046, China)

[Abstract] Objective:To develop a method for the determination of high polyer impurities in biapenem. Methods:Gel permeation chromatography method was adpoted.The analytical column was Sephadex G-10 stainless steel column (10 mm×300 mm), the mobile phase A:was phosphate buffer(dissolve 5.59 g of potassium dihydrogen phosphate and 0.41 g monopotassium phosphate in water to make 1 000 ml), and the mobile phase B was water; The flow rate was about 0.3 ml per minute; The detective wavelength was 254 nm; The volume of injection was 200 μl; The column temperature was room temperature;Reference standards Faropenem. Results: The calibration curves of high polyler impurities in biapenem was in good linearite over the range of 100.40～400.55 mg/ml(r=0.999 9). Conclusion: Gel permeation chromatography issensitive,specific,accurate and reliable, it is suitable to the determination of high polyler impurities in biapenem.

[Key words] Gel permeation chromatography;Biapenem;High polyler

比阿培南是美国Wyeth公司研发的新型1β-甲基碳青霉烯类抗生素。β内酰胺类抗生素变态反应与药物中存在的高分子杂质有关[1-2],β内酰胺类抗生素在以水为流动相中可以缔合形成表观分子量较大的缔合物,缔合物在Sephadex G10凝胶色谱系统中色谱行为和高分子杂质一样,Kav=0处表现为单一色谱峰这一特点,采用了自身对照外标法对高分子杂质进行精确定量[3-4],实验表明比阿培南比较难于在水溶液中聚合,且聚合物分子量与单体相差不大,给分离分析带来难度,但比阿培南在受热时会产生高分子聚合物,因此建议将比阿培南聚合物纳入质量控制指标。本文利用葡聚糖凝胶Sephadex G10色谱系统实现了对比阿培南中高分子聚合物的分离分析。

1 试剂与材料

LC-20AT泵,SPD-20A紫外检测器,LCsolution工作站(日本岛津公司); AG135电子分析天平(美国梅特勒托利多公司)。

比阿培南供试品(哈药集团制药总厂,批号:200909001-3、200909002-3、200909003-3);磷酸二氢钾(分析纯,天津市科密欧化学试剂开发中心);水为mili-Q超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:采用葡聚糖凝胶Sephadex G-10不锈钢柱(10 mm×300 mm),流动相A:磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾5.59 g,与磷酸二氢钾0.41 g,加水使溶解成1 000 ml);流动相B:水;流速:0.3 ml/min;检测波长为254 nm,进样量为200 μl。用流动相B为流动相,蓝色葡聚糖2000 进行测定,理论板数为1 429。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液取法罗培南对照品约10 mg,精密称定, 置10 ml 容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1 ml 置10 ml 容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀。

2.2.2 供试品溶液取比阿培南约0.2 g,精密称定,置10 ml 容量瓶中,加流动相A 溶解并稀释至刻度,摇匀,立即进样。

2.3 对照溶液重复性试验

以流动相B为流动相,精密量取对照溶液200 μl,连续进样5次,记录峰面积为45 870 295、42 289 715、43 473 020、44 797 807、43 903 176,计算峰面积的相对标准偏差为3.07%,重复性较好。

2.4 对照品溶液浓度与峰面积线性关系考察

取法罗培南对照品10.07 mg,置10 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0 ml于10 ml量瓶中,用水稀释至刻度,以流动相B为流动相,分别取200 μl注入液相色谱仪,对照品浓度在20.14～201.40 μg/ml范围内对峰面积呈良好线性,回归方程为A=467 413.653 2C-107 018.364(r=0.999 9)。

2.5 高分子聚合物峰的线性范围

因为比阿培南样品200909001-3不含有高分子聚合物,为考察该方法高分子聚合物峰的线性范围,将200909001-3批在105℃放置4 h高温破坏后,分别称取100.40 mg、199.65 mg、400.55 mg配制成不同浓度的供试液, 进样200 μl 测定聚合物的峰面积分别为1 208 775、2 382 568、4 707 626。以比阿培南高分子聚合物的峰面积为纵坐标,浓度(mg/ml) 为横坐标,求得回归方程:Y= 46 874.459 1+11 644.811 0X,r=0.999 9。结果:供试液浓度在100.40～400.55 mg/ml范围内对聚合物的峰面积呈良好线性关系。

2.6 影响色谱行为的因素考察

2.6.1 流速考察 因为比阿培南聚合物为寡聚物,与比阿培南单体分子量十分接近,难于分离,降低流速能使二者分离,分别考察流速为1.0、0.8、0.5、0.3 ml/min时二者分离情况,以流速为0.3 ml/min时分离效果最好。

2.6.2 法罗培南对照品的选择 因为比阿培南比较难于在水溶液中聚合,且聚合物分子量与单体相差不大,很难采用自身对照外标法对高分子杂质进行精确定量[5-6],因此采用结构相似的法罗培南作为外标法的对照品进行计算,并将计算结果乘以0.994。

2.7 样品测定

取供试品约0.2 g,精密称定,置10 ml 容量瓶中,加流动相A 溶解并稀释至刻度,摇匀,立即取200 μl 注入色谱仪,以流动相A 为流动相进行测定,记录色谱图;另取对照品溶液200 μl 注入色谱仪,以流动相B 为流动相进行测定,记录色谱图,按外标法计算,并将计算结果乘以0.994。测定结果为3 批样品(200909001-3、200909002-3、200909003-3) 聚合物含量均为0%。

3 讨论

根据在特定条件下,法罗培南可以缔合形成分子量较大的缔合物,缔合物在Sephadex G10 凝胶色谱系统中和高分子杂质一样,都在Kav=0处表现为单一的色谱峰的特点,本文采用法罗培南作为外标法的对照品对聚合物峰进行定量。用凝胶色谱法测定比阿培南聚合物的含量,方法简便,结果可靠,可以用于比阿培南中高分子聚合物杂质的检测。

[参考文献]

[1]Schwartz MA. Chemical aspects of penicillin allergy[J].J Pham Sci,1969,58(6):643.

[2]Ahlstedt S,Kristofferson A,Svard PO,et al. Ampicillin polymers as elicitiors of passive cutaneous anaphylaxis[J].Int Arch Allergy Appl Immunol,1976,51(1):131.

[3]胡昌勤,金少鸿,孙学兰. 离子对凝胶色谱法分离头孢菌素中高分子杂质[J].中国抗生素,1990,15(5):357.

[4]Changqin H,Shaohong J,Kaimin W. Chromatographic behaviour of cephalosperins in gel filtration chromatography,a novel method to separate high molecular weight impurities[J].J Pharmaceutic B,1994,12(4):533.

[5]胡昌勤,孙丽丽,金少鸿.β内酰胺抗生素在Sephadex G10凝胶色谱中色谱行为的定量关系[J].药物分析杂志,1997,12(2):78.

[6]胡昌勤,金少鸿. 自身对照外标法定量测定β内酰胺类抗生素中的高分子杂质[J].中国抗生素杂志,1997,22(1):23.

(收稿日期:2010-01-25)