苯胺及其部分衍生物对Bt亚种HD―1的毒理作用

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摘要：以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thutingiensis Berlinert）亚种HD-1菌株为指示菌，采用比浊法测定其生长曲线，研究苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺对HD-1的生长抑制毒性，应用等比法分别测定每种化合物的剂量-效应数据，采用最小二乘拟合进行非线性拟合。结果表明，苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺对标准菌HD-1的24 h EC50 分别为：0.034 901、0.004 967、0.004 797、0.004 686 mol/L，苯胺及苯胺衍生物对HD-1的毒性从小到大顺序为苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺。

关键词：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thutingiensis Berliner）;苯胺;衍生物;抑制率;剂量-效应曲线

中图分类号：X171.5;Q938.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4848-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.020

Toxicological Effects of Aniline and Some of Its Derivatives on Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki Strain HD-1

LIU Jian-guo， LUO Wen， ZHU Gui-mei， HAO Zai-bin， LIU Hong-yan

（Chemical and biological engineering college， Guilin university of technology， Guilin 541004， China）

Abstract：The growth curve of the indicator， Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD-1， and the growth inhibition effects of aniline and some of its derivatives on strain HD-1 were studied by turbidimetry. The dose-responses of each compound were determined by the ratio method. The least square method was used for nonlinear fitting. The results showed that the EC50 values of aniline， o-chloroaniline， m-chloroaniline and p-chloroaniline for strain HD-1 at 24 h were 0.034901， 0.004967， 0.004797 and 0.004686， respectively. For aniline and some of its derivatives， the toxicity to strain HD-1 was in the order of aniline < o-chloroaniline < m-chloroaniline < p-chloroaniline.

Key words：Bacillus thuringiensis; aniline and some of its derivatives; inhibition rate; DRC

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thutingiensis Berliner，简称Bt），是一种革兰氏阳性土壤杆菌，属于芽孢杆菌属，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链状[1-3]。在生长代谢过程中会形成芽孢，在芽孢形成过程中产生δ-内毒素杀虫伴胞晶体蛋白（ICP），ICP具有很高的杀虫活性且对多种生物有毒力，敏感昆虫一旦摄入，就可能致死[4，5]。由于这种杀虫作用专一，对环境无害，对人畜安全，在许多国家和地区得到推广，Bt制剂逐步发展成为世界上应用最广泛的微生物杀虫剂之一。目前，苏云金杆菌制剂广泛用于粮食作物、经济作物与园艺作物害虫、林业害虫的防治[6-8]。苏云金芽孢杆菌以原生态的生长环境中居多，环境中的有毒化合物对它生长的抑制作用研究鲜见报道。

环境细菌生长抑制试验是毒理学生物测定的常用方法之一，与传统生物毒性测定试验方法相比，该方法费用低廉，占用空间相对较小，反应灵敏，可在相对较短的时间内评价化学品的毒性，提供有意义的毒性指标，预测化学物质进入环境可能引起的危害，适用于筛选和指示各种类型的环境毒物[9]。本研究采用现代毒理学中的生物方法[10]研究苯胺及氯苯胺对Bt亚种HD-1的毒性作用，为苯胺类环境污染物的环境毒性评估和风险评价提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 标准Bt亚种菌株HD-1，中国农业科学院植物保护研究所提供。

1.1.2 试剂 苯胺（A1）、邻氯苯胺（A2）、间氯苯胺（A3）、对氯苯胺（A4）均为化学纯。

1.1.3 主要仪器设备 微电脑控制振荡培养箱（广东医疗器械厂，LRH-150-2Ⅱ型）;微电脑控制生化培养箱（广东医疗器械厂，LRH-250-2Ⅱ型）;紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司，TU-1800S型）;移液枪（上海荣泰生化工程有限公司）。

1.1.4 培养基 种子培养基（1/2 LB固体培养基）：蛋白胨0.5%，酵母浸膏0.25%，氯化钠0.5%，琼脂粉1.5%，用氢氧化钠调pH至7.0～7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min[11]。

发酵培养基（LB培养基）：蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，氯化钠1.0%，用氢氧化钠调pH至7.0～7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 HD-1的活化 配制 1/2 LB固体培养基，倒入平板，平板冷却凝结后，取出保存的HD-1菌株，用接种环挑取菌体在平板培养基上均匀划线。将培养皿置于28 ℃生化培养箱中培养24 h，放入4 ℃冰箱保存，用于一级培养。

1.2.2 HD-1生长曲线的测定 配制LB培养基。将配制好的LB培养基分别量取120 mL于250 mL三角瓶中，平行2个样，包扎好瓶口后进行121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。灭好菌后，挑取2环已活化24 h的HD-1菌体置于LB培养基中，30 ℃恒温170 r/min振荡培养。每4 h取样1次，在波长600 nm下检测OD 600 nm，培养至36 h，共取样9次。

1.2.3 苯胺及其部分衍生物对bt亚种hd-1的毒性作用 将HD-1 的一级培养菌液稀释10倍，分别加到48个离心管中，每管稀释菌液体积为1 mL。每个毒物设置12个梯度浓度，见表1。各管中LB培养基体积均为7 mL，以无菌水补足使每管体积为10 mL。其中，加毒物溶液组为试验组，对应加等量无菌水的为空白对照组，1组空白对照，3组平行试验组。24 h后检测OD600 nm，每组平行测3次OD600 nm，计算抑制率。抑制率=（对照组OD600 nm -试验组OD600 nm）/对照组OD600 nm×100%[12]。计算化合物对HD-1的抑制率。应用等比法分别测定每种化合物的剂量-效应数据，采用最小二乘拟合进行非线性拟合，应用Logistic 函数拟合各化合物对HD-1的毒性剂量-效应曲线。

2 结果与分析

2.1 BT亚种的生长曲线的绘制

以时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标，作图得到HD-1的生长曲线。HD-1的生长曲线见图1。

图1表明，生长曲线出现了明显的延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。12～24 h是对数生长期，此时期的菌液适于做种子;在24 h这一时间点处菌体浓度最大，表明这一时间点最适合检测菌体发酵液的OD600 nm。

2.2 苯胺及其部分衍生物对Bt亚种HD-1的单一毒性作用

计算得到苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺和对氯苯胺分别对HD-1的毒性剂量-效应曲线分别见图2、3、4、5。对苯胺对HD-1毒性剂量-效应曲线进行拟合，DRC模型呈S形，是按半数效应对称的，计算得到苯胺的EC50=0.034 901 mol/L;拟合邻氯苯胺对HD-1毒性剂量-效应曲线，DRC模型也呈S形，低浓度毒物对HD-1菌的抑制作用不稳定，偶尔会出现刺激生长情况，邻氯苯胺的EC50=0.004 967 mol/L;拟合间氯苯胺对HD-1毒性剂量- 效应曲线，DRC模型呈S形。低浓度梯度毒物对HD-1菌的抑制作用不稳定，偶尔会出现刺激菌体生长情况，偏差较大，而且试验重现性差，计算得到间氯苯胺的EC50=0.004 797 mol/L;拟合对氯苯胺对HD-1毒性剂量- 效应曲线，DRC模型同样呈S形，计算得到对氯苯胺的EC50=0.004 686 mol/L。

3 结论

1）HD-1生长曲线出现了明显的延缓期、对数期、稳定期和衰亡期，12～24 h是对数生长期，此时期的菌液适于做种子;在24 h这一时间点处菌体浓度最大，表明这一时间点最适合检测该菌发酵液的OD600 nm。

2）在24 h时，苯胺、邻氯苯胺和间氯苯胺各浓度梯度对HD-1均有毒性作用，且相对稳定，高浓度梯度对菌体的抑制作用明显。对氯苯胺较高浓度（0.005 877 mol/L）对HD-1的抑制作用明显，但到0.001 926 mol/L开始出现刺激菌体生长现象，且低浓度梯度的菌体生长不稳定。苯胺及氯苯胺对HD-1的毒性剂量-效应模型均呈S形，苯胺的EC50=0.034 901 mol/L，邻氯苯胺的EC50=0.004 967 mol/L，间氯苯胺的EC50=0.004 797 mol/L，对氯苯胺的EC50=0.004 686 mol/L。这4种化合物的实测毒性与模型估算效应之间的相关系数都达0.95以上。比较苯胺及氯苯胺对HD-1毒性半数效应浓度的大小可知，这4种苯胺类化合物的毒性从小到大依次为苯胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺。

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