叶下珠复方治疗肝炎的免疫作用研究
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摘要：通过小鼠四氯化碳、D-半乳糖胺盐酸盐急性肝损伤模型、小鼠炭粒廓清实验、免疫肝损伤模型研究叶下珠复方对肝损伤的保护作用以及有关免疫药理作用，结果表明：(1) 叶下珠复方有保肝降酶的作用，对慢性肝细胞损伤可起到积极的保护作用。对四氯化碳（CCL4），D-半乳糖胺盐酸盐所致的急性肝损伤以及卡介苗（BCG）和脂多糖（LPS）造成的免疫性肝损伤具有明显的保护作用，其降酶效果与阳性药物联苯双酯相当。 (2) 叶下珠复方对免疫系统具有调节作用，对小鼠体液免疫功能呈抑制作用，能增强小鼠网状内皮系统的吞噬功能。叶下珠复方有一定的免疫调节作用。
关键词：叶下珠复方；慢性乙型肝炎；免疫作用
中图分类号：R512.6 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2008）04-0838-03
叶下珠复方（PUL）是由叶下珠、三七、黄芪等5味药组成的复方，系根据中医药治疗乙肝的临床经验，结合体内外实验结果优选出的一种既能抑制乙肝病毒复制，又能改善免疫功能与保护肝脏机能的中药复方制剂，在临床运用有一定的疗效。根据中药治疗作用的特点主要是通过对人体免疫功能的影响起到调节作用。本研究主要观察其对肝损伤的保护作用以及有关免疫药理作用，为进一步研究开发提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料叶下珠复方，每粒胶囊含生药1.2g，用时以蒸馏水稀释成不同浓度。
1.2实验动物NIH小鼠由广东省实验动物中心提供，雌雄各半，体重（21±2）g。实验动物质量和条件合格证书：26-99A028，26-99B023。小鼠饲养环境：室温：（23±20）℃，相对湿度（75±10）%。每天光照12h。
1.3药品与试剂 联苯双酯滴丸：北京协和药厂生产，批号：981108。卡介苗冻干粉（BCG）：60mg/支，含菌量：300-700万个/mg。陕西省生物制品研究所提供，批号：20003001。大肠杆菌脂多糖（LPS）：美国Sigma公司产品。血清谷胺酰丙氨酸转移酶（ALT）和血清谷胺酰天冬氨酸转移酶（AST）测定试剂盒为卫生部上海生物制品研究所生产。批号：980302、990701。四氯化碳由广州化学试剂厂生产，批号：960707。D-GlaN由重庆医科大学化学教研室提供，批号970728。鸡红细胞抗原、都氏剂、补体（豚鼠血清）均常规方法配制。
1.4药物剂量设置叶下珠复方大剂量：10g/kg；叶下珠复方中剂量：5g/kg；叶下珠复方小剂量：2.5g/kg。灌胃给药，给药容积：20mL/kg，每天给药1次。
1.5主要仪器752型紫外光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。台式高速离心机，军事医学科学院实验仪器厂。
1.6统计学处理采用计算机统计软件进行数据处理。两个样本均数间的比较用t检验。多个样本均数间的比较用方差分析（方差齐时）或秩和检验（方差不齐时）。
2实验方法与结果
2.1对小鼠四氯化碳 D-半乳糖胺盐酸盐急性肝损伤模型的保护作用NIH小鼠随机分组，每组10-15只，设空白对照组、模型组，叶下珠复方3个剂量组，联苯双酯对照组。每日口服给药1次，共给药4次，最后1次给药后1h，给小鼠（空白对照组除外）腹腔注射0.2mL/20g1%四氯化碳花生油溶液和D-半乳糖胺650mg/kg，动物于注射肝脏毒物后禁食过夜，16h后断头处死取血，分离血清，采用赖氏法在自动生化分析仪（4010型）上测定血清转氨酶的含量，结果见表1、表2。
从表1、表2中可以看出，模型组小鼠肝组织损伤严重，血清ALT、AST水平显著升高，叶下珠复方高、中、低3个剂量组能显著降低CCl4 急性肝损伤模型小鼠的血清ALT、AST的水平，差异有统计学上意义，其中叶下珠复方大剂量的降酶作用与联苯双酯相当。对D-半乳糖胺急性肝损伤小鼠叶下珠复方的3个剂量组均体现出保护作用，以小剂量组的作用最为明显。
2.2叶下珠复方对小鼠炭粒廓清率的影响取NIH小鼠60只，雌雄各半，随机分组，分组与剂量如表3所示。每鼠灌胃给药10天，每天1次；云芝多糖隔天1次共5 次，末次给药后尾静脉注射墨汁0.01mL/10g；墨汁一经注入，立即计时。于注射后1min（t1）和10min（t2）分别用吸管经眼内眦静脉取血0.02mL(吸管在吸取血液前吸吹一下20单位/mL浓度的肝素溶液，以防血液凝固)。将血液加入盛有0.1%Na2CO3溶液2mL试管中，摇匀，用721分光光度计，在650nm波长处测光密度，记录OD值。取血后颈椎法处死动物，取出小鼠肝脏与脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。吞噬系统指数按下列公式计算；
从表3结果显示：叶下珠复方大中小3个剂量组吞噬系统指数与正常对照组相比，P
2.3叶下珠复方对机体体液免疫功能的影响（小鼠溶血素试验）取体重18～22gNIH小鼠，雌雄兼用，随机分成6组，每组10只，分组与剂量见表4,给药组每天给药1次(叶下珠复方口服给药，环磷酰胺皮下给药)。每天给药1次，连续7天，于实验第1天每鼠腹腔注射2%生理盐水鸡红血球混悬液0.2mL进行免疫，免疫后第7天，末次给药后1h，用摘除眼球法取血置于离心管内，室温放置约1h，用眼科玻璃棒将凝固血沿管壁轻轻剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，取血清用SA缓冲液稀释(一般为200倍左右)，供测定用。取稀释后血清1mL置试管内，依次加入10%鸡红细胞0.5mL，补体1mL（用SA液1∶10稀释）发生溶血反应。放置37℃恒温水浴中保温15～30min，反应完毕，将管移入冰浴中终止反应，2000r/min离心10min，取上清液1mL加都氏剂3mL，摇匀放置10min，于540nm波长比色，记录各样品的吸收度值。鸡红细胞半数溶血值：取10%鸡红细胞0.25mL加都氏剂至4mL，比色读取吸光度值。样品中的溶血素以半数溶血值（HC50）表示：样品HC50=样品吸收度值/鸡红细胞半数溶血时的吸收度值×稀释倍数。结果见表4。
从表4结果可以看出,阳性药物环磷酰胺40 mg/kg与20 mg/kg中半数溶血数值与正常对照组相比,P
2.4叶下珠复方对免疫性肝损伤的作用将动物按体重随机分组，动物造模组及用药组每只尾静脉各注射卡介苗0.2mL（含菌量约为：5×106/只），对照组注射等容积生理盐水0.2mL。12天后每尾静脉注射脂多糖0.2mL（浓度约10μg/尾）。给药组每日给药1次，于感染BCG后12天，末次给药2h后，静脉注射LPS10μ/鼠，16h后测血清转氨酶水平。给药组于第1天注射卡介苗后次日起每天灌药0.4mL，连续12天。常规分离血清，按试剂盒进行测定ALT。结果见表5。
结果表明模型对照组的谷丙转氨酶水平明显升高，阳性药物联苯双酯75mg/kg浓度时能降低谷丙转氨酶的水平，与文献报道的结果相一致。叶下珠复方144 mg/kg剂量时显示出降低谷丙转氨酶水平的作用，与模型组相比，P
3讨论
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是人类最常见的病毒性感染之一［1］，我国人群中慢性HBV携带者约占10%～15%，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者中每年发生肝硬变和肝细胞癌者，分别占2%和1%。因此乙型肝炎病毒严重地威胁着人类的健康，加强抗乙肝病毒药物的研制开发研究已成为当务之急。鉴于慢性病毒性肝炎的发病机理复杂，其治疗关键是抑制和清除病毒、调整机体免疫、保护肝细胞、阻断慢性肝纤维化、肝癌的发展［2］。
本实验结果表明，在对抗四氯化碳、D-半乳糖胺急性肝损伤实验中，叶下珠复方10g/kg、5g/kg、2.5g/kg3个剂量均有不同程度的抗肝损伤作用。叶下珠复方10g/kg剂量下显示出与联苯双酯组疗效相当的抗四氯化碳损伤作用。但叶下珠复方各剂量组的作用并未呈现量效关系。叶下珠复方能调动巨噬细胞的吞噬作用，提升小鼠体内炭粒廓清功能，增强小鼠单核巨噬细胞吞噬功能。叶下珠复方中小剂量对小鼠体液免疫功能呈抑制作用，与环磷酰胺作用相类似，但大剂量则未显示出抑制作用。叶下珠复方的这一作用对于慢性肝炎的发病经常表现出体液免疫功能亢进的病理有良好的作用。
已有研究表明，肝内免疫反应是引起肝损伤的重要机制之一，调节免疫功能在病毒性肝炎治疗过程中具有重要地位。采用BCG加LPS联合诱导小鼠产生免疫性肝损伤，病理损伤的组织学特点主要有灶性肝细胞坏死，汇管区周围大量炎细胞浸润；其发病机制可能与肝脏的枯否细胞(KC)和游入肝组织的炎症细胞功能状态密切相关［3］。研究结果表明，用BCG加LPS诱导的免疫性肝损伤模型鼠血清ALT的活性明显升高，病理学检查结果也与文献报道基本相符［4］ 。联苯双酯能降低模型鼠ALT转氨酶的活性，说明本实验所建立的小鼠免疫性肝炎模型的成功。研究表明本药能显著抑制肝损伤与小鼠血清ALT活性的升高，较明显地减轻或改善肝细胞形态学变化。叶下珠复方2.5g/kg剂量组的降酶效果与联苯双酯相当，而叶下珠复方10g/kg剂量组ALT平均水平虽与模型组相比数值有较大差异，但统计学上未显示出显著性差异（P>0.05），这可能与动物例数太少有关。
参考文献
［1］Lau GKK, Carman WF,Locarnini SA, et al. Treatment of chronic B virus infection: An Asia-Pacific perspective ［J］. J Gastroenterol&Hepatol, 1999,14:3.
［2］姚桢.慢性肝病的治疗旨在阻断癌变［J］.中西医结合肝病杂志，1998，8（1）：3.
［3］王根生，刘耕陶.枯否氏细胞与肝细胞损伤［J］.中国药理学通报，1994，10（5）：330.
［4］Wang GS, Liu GT. Role of nitric oxide in immunological liver damage in mice ［J］. Biochem Parmacol,1995，49:1277.