内质网应激相关蛋白在百草枯致大鼠急性肺损伤中的变化

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DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.012

基金项目：辽宁省教育厅高等学校科研基金资助项目（L2010682）

作者单位：110004 沈阳，中国医科大学附属盛京医院急诊科

通信作者：戢新平，Email：

百草枯（paraquat，PQ）又名对草快，其20%的溶液称克无踪，是一种有机杂环类触杀、灭生型高毒性除草剂。人类误服百草枯后，无特效解毒剂，中毒病死率极高[1]，其主要死因早期为急性肺损伤[2]，后期进展为不可逆性肺纤维化[3]。百草枯中毒的发病机制尚未完全清楚[4]，大量研究显示细胞凋亡参与百草枯所致的急性肺损伤[5]。本研究通过建立百草枯中毒大鼠的急性肺损伤模型，初步探讨内质网应激途径介导的细胞凋亡在百草枯诱导的大鼠急性肺损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级Spragne-Dawley（SD）大鼠80只，雄性（由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供），体质量200～250 g。

1.2 主要试剂与仪器

20%百草枯水溶液购于中国先正达南通作物保护有限公司（用无菌生理盐水将1 mL克无踪稀释至100 mL混匀，配制成2 mg/mL溶液）；兔抗葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein，GRP78）、兔抗生长停滞和DNA损伤诱导基因153（C/EBP homology protein/growth arrest and DNA damage-inducible gene，CHOP/GADD153）多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；GAPDH多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；超敏二步法免疫组化检测试剂购自中国北京中杉金桥生物技术有限公司。显微镜型号：日本Nikon E800。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型建立 根据预实验结果设计，因染毒组在实验过程中有死亡，故增加实验动物数量，以保证所观察的各个时间点动物数量相同。SD大鼠随机（随机区组法）分为对照组（40只）、百草枯染毒组（40只）。①百草枯染毒组（简称PQ组）：按20 mg/kg计算，腹腔注射配制的百草枯溶液；②对照组：给予0.9%的无菌生理盐水（NS）等量腹腔注射。对照组及染毒组于给药后8 h、1 d、3 d、5 d各处死10只大鼠。左肺用4%多聚甲醛固定，HE染色及免疫组织化学测定；右肺迅速-80 ℃冷冻保存，行Western blot蛋白测定。

1.3.2 病理学检查 肺组织用4%多聚甲醛溶液固定后，常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，光镜下观察肺组织病理改变。

1.3.3 Western blot法检测GRP78、CHOP蛋白表达 取各组大鼠肺组织各100 mg，加入1 mL组织蛋白裂解液后剪碎组织，匀浆机将组织超声裂解后，取匀浆液4 ℃15 000 r/min离心20 min。取上清液，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白变性，上样，经10%SDS-PAGE 凝胶电泳。湿转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭1h后，分别加入兔抗大鼠 GRP78 多克隆抗体（1∶ 1 000 稀释）、兔抗大鼠CHOP多克隆抗体（1∶ 1 000 稀释）和GAPDH（1∶ 2000稀释）4 ℃振荡孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG（1∶ 2000 稀释）室温1 h。TBST洗涤后，利用ECL 超敏发光液， X 线胶片曝光、显影。以 GAPDH 为内参照。采用分子生物学图像分析系统进行定量扫描测定条带灰度值， 将每个样本的灰度值与相应 GAPDH 的灰度值相比， 计算蛋白的表达水平。

1.3.4 免疫组织化学法检测GRP78、CHOP蛋白表达 取石蜡切片（4 μm），常规脱蜡、水化。滴加3%H2O2去离子水室温孵育20 min，柠檬酸盐缓冲液微波加热修复抗原，滴加一抗（兔抗大鼠GRP78、CHOP多克隆抗体，抗体稀释的工作浓度均为1∶ 200，另外采用PBS代替一抗的方法制备阴性对照）4 ℃过夜。滴加Polymer Helper的二抗37 ℃ 30 min，滴加poly-HRP anti-Rabbit IgG 37 ℃30 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。显微镜下照相，采用全自动图像分析系统（NIS-Elements Br3.0）分别计算其平均光密度，取其均值分析。

1.4 统计学方法

计量资料以均数±标准差（x±s）表示， 采用 SPSS 17.0软件分析，单因素方差分析法比较多个样本均数、LSD-t检验法进行均数之间的两两比较，以P

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理特点

（1）大体观察：对照组大鼠肺脏呈粉红色，包膜光滑；染毒组8 h大鼠肺组织局部出现轻度充血，染毒1 d、3 d、5 d大鼠肺组织充血逐渐加重，体积逐渐增大，部分肺呈弥漫性出血，染毒5 d大鼠肺组织有大面积出血点及瘀血。

（2）光镜观察：正常组大鼠肺组织结构清楚，肺泡腔内无炎性细胞，肺泡间隔正常，无炎性细胞浸润及纤维组织增生；染毒8 h大鼠肺组织内少量中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞，其中以中性粒细胞为主，肺组织结构基本正常；染毒1 d大鼠肺组织炎性细胞浸润有所增加，部分肺泡间隔断裂，肺泡腔内有红细胞、水肿液聚集，肺组织结构仍处于正常状态。染毒3 d大鼠肺泡腔及肺间质内大量炎性细胞浸润，肺间隔断裂明显，局部出现典型肺大泡表现。染毒5 d炎性细胞浸润及肺组织结构破坏进一步增加见图1。

2.2 大鼠肺组织中GRP78、CHOP蛋白表达

对照组8 h、1 d、3 d、5 d中GRP78/GAPDH灰度比值为（0.78±0.0339、0.76±0.0491、0.771±0.0533、0.775±0.0313），PQ组8 h、1 d、3 d、5 d中GRP78/GAPDH灰度比值为（1.361±0.2466、0.936±0.138、0.85±0.0889、0.528±0.1123），E组与A组比较差异具有统计学意义（t=7.92，P

免疫组化染色显示，正常大鼠肺组织中仅有少数细胞胞浆呈浅黄色，染毒组大鼠肺组织细胞的阳性表达呈棕黄色，较对照组染色明显增强，且染毒8 h组阳性表达最多，GRP78阳性表达主要位于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞以及少量的肺血管内皮细胞的胞浆内。而CHOP阳性表达主要位于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞的胞核内，仍是染毒8 h组阳性表达最多。对照组及染毒组大鼠肺组织中GRP78、CHOP表达具体情况见图3及表1。E组与A组比较差异具有统计学意义（t=62.36、15.69，P

3 讨论

百草枯中毒引起急性肺损伤的机制十分复杂，近年来研究发现，肺组织细胞凋亡在百草枯诱导的急性肺损伤中扮演着重要角色。目前已知的细胞凋亡信号转导存在3条途径分别为死亡受体活化途径、线粒体途径、内质网应激途径。

胡军利和佟飞等[6-7]研究发现百草枯中毒大鼠肺泡巨噬细胞产生大量肿瘤坏死因子（TNF-α），TNF-α与细胞膜上 的肿瘤坏死因子受体（TNFR）结合启动死亡受体活化途径，诱导细胞凋亡。Dinis-Oliveira等[8]研究发现，百草枯导致大鼠肺组织P53、AP-1表达增加，造成线粒体膜电位下降，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（permeability transition pore，PTP）大量开放，细胞凋亡启动因子从线粒体释放，激活caspase-3，诱导细胞凋亡。而内质网应激途径是否参与百草枯诱导的大鼠急性肺损伤在国内外文献中未见相关报道。

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指多种生理或病理条件引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网聚集，损伤内质网的正常生理功能。缺氧、饥饿、营养物质缺乏（包括氨基酸、葡萄糖等）、毒性物质（如重金属）、氧自由基、钙离子平衡失调、蛋白质糖基化与折叠抑制均可引起内质网应激[9]。

正常状态下，分子伴侣葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白重链结合蛋白（glucose-regulated protein 78/ binding immunoglobulin protein， GRP78/ BIP）与3个内质网应激感受蛋白[包括抑制物阻抗性酯酶1（Inositol-requiring enzyme 1，IRE-1）、双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）]结合，处于无活性状态[10]。

当内质网处于应激状态时，GRP78/BIP与3个跨膜应激感受蛋白解离，并与错误折叠蛋白或未折叠蛋白结合，同时解离后的感受蛋白通过各自的信号传导途径启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），减少未折叠或错误折叠蛋白在内质网内累积，促进其降解。因此， ERS标志性蛋白GRP78表达增加一定程度上反映了ERS的启动[11]。但过强或持续时间过长的ERS可激活下游的凋亡信号分子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enchancer-binding protein-homologous protein，CHOP），又称生长停滞和DNA损伤诱导基因153（growth arrest and DNA damage inducible gene 153，GADD153），启动细胞凋亡。CHOP/ GADD153 是 ER 应激特异的转录因子，属于C/EBP转录因子家族成员，正常情况下存在于细胞质内表达量少，但在内质网应激情况下其表达上调并转位至细胞核，调控靶基因表达，介导细胞凋亡、调控细胞分化等[12-13]。本实验采用文献[14]的方法成功建立百草枯大鼠急性肺损伤模型，通过检测内质网应激特异性指标GRP78和CHOP发现百草枯染毒8 h、1 d组大鼠肺组织中GRP78及CHOP蛋白表达水平明显增加，提示百草枯诱导大鼠急性肺损伤启动了内质网应激，并且诱导了细胞凋亡的发生。

百草枯中毒可产生大量活性氧自由基[4]，内质网对氧化应激反应敏感，其作为活性氧主要攻击的目标，同时百草枯造成细胞内钙超载，导致钙稳态失衡[15]，也可能启动内质网应激。内质网应激早期启动的非折叠蛋白反应，实质上属于一种自我保护机制，在早期干预，可使细胞恢复正常生理功能，由此推测若早期通过药物干预百草枯造成的肺损伤，能否阻止细胞凋亡的发生。

参考文献

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（收稿日期：2013-12-22）

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