芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠Th17相关细胞因子的影响
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[摘要] 目的 研究芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠th17相关因子的影响，探讨芍药汤治疗胃肠湿热型溃疡性结肠炎的机制。 方法 将40只清洁级大鼠随机分为空白组、模型组、芍药汤组及柳氮磺吡啶（SASP）组；除空白组外，其他三组大鼠制成胃肠湿热型模型后，再用三硝基苯磺酸（TNBS）造模成溃疡性结肠炎模型；灌胃治疗14 d后，处死大鼠前对其进行疾病活动指数（DAI）评分，完毕后麻醉大鼠，腔静脉取血，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中细胞因子白细胞介素17（IL-17）、γ干扰素（IFN-γ）及白细胞介素27（IL-27），并取病变结肠进行结肠大体形态损伤指数（CMDI）评分。 结果 DAI评分及CMDI评分方面，与空白组比较，模型组明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01），治疗后芍药汤组评分低于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；血清IL-17方面，模型组明显高于空白组，芍药汤组明显低于模型组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；大鼠血清IFN-γ及IL-27方面，模型组明显低于空白组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），芍药汤组高于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 芍药汤能明显降低胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠血清中IL-17水平，并可相应升高其血清中IFN-γ及IL-27水平，其可能为治疗溃疡性结肠炎的有效机制之一。
[关键词] 芍药汤；溃疡性结肠炎；胃肠湿热；Th17相关细胞因子
[中图分类号] R574.620.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）05（a）-0008-04
[Abstract] Objective To study the effect of Shaoyao Decoction on Th17 related cytokines of rats with ulcerative colitis of syndrome of damp-heat in stomach and intestine， so as to investigate the mechanism of Shaoyao Decoction in the treatment of ulcerative colitis. Methods Forty rats were randomly divided into blank group， model group， Shaoyao Decoction group， Salazosulfapyridine （SASP） group. Except for the blank group， the rats of the other three groups were built as models of syndrome of damp-heat in stomach and intestine， then they were made into ulcerative colitis models by trinitro-benzene-sulfonic acid （TNBS）. After 14 days' lavage treatment， all rats were firstly given a mark on disease activity index （DAI） before death， then they were narcotized to drew blood from venae cavae for measuring the interleukins-17 （IL-17）， γ-interferon （IFN-γ） and interleukins-27 （IL-27） in serum by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， finally， the abnormal tissues were chosen to make scores of colon macroscopic damage index （CMDI）. Results On DAI and CMDI scores， compared with the blank group， the model group was increased， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）， after treatment， the Shaoyao Decoction group was lower than the model group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）； On the levels of IL-17， the model group was higher than the blank group， while the Shaoyao Decoction group was lower than the model group， the differences were all highly statistically significant （P < 0.01）； On the levels of IFN-γ and IL-27， the model group was lower than the blank group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）， while the Shaoyao Decoction group was higher than the model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Shaoyao Decoction can obviously reduce the levels of serum IL-17 in rats with ulcerative colitis of syndrome of damp-heat in stomach and intestine， increase the levels of serum IFN-γ and IL-27， which maybe one of the mechanisms of Shaoyao Decoction in the treatment of ulcerative colitis.
[Key words] Shaoyao Decoction； Ulcerative colitis； Syndrome of damp-heat in stomach and intestine； Th17 related cytokines
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种主要累及结肠、直肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症，属病因不明的炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）范畴[1]。UC发病机制目前尚未明确，其可能与环境、饮食、感染、遗传及免疫等因素有关，其中，免疫因素在UC发病中作用已经被广泛接受[2]。相关研究发现，Th17相关因子[主要指白细胞介素17（IL-17）、γ干扰素（IFN-γ）及白细胞介素27（IL-27）]在UC的发病及愈合中有着重要作用[3-4]。目前西医治疗UC常用免疫抑制剂、激素和抗生素；中医中药对于UC也有较好效果，虽然治疗作用有双向性且毒副作用发生率低，但其机制不清，芍药汤是中医临床治疗胃肠湿热型UC的常用方剂，临床收效可观。本研究通过观察芍药汤对胃肠湿热型UC大鼠血清IL-17、IFN-γ及IL-27的影响，试从细胞层面探讨芍药汤对UC的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重180～200 g，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SYXK（湘）2013-0005]。实验前，所有大鼠均在通风、温度、湿度适宜的动物室内适应性饲养1周。
1.1.2 器材 3K-30Z型高速冷冻离心机（Sigma公司）；大鼠IL-17酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；大鼠IL-27 ELISA检测试剂盒[杭州豪普斯生物有限公司，试剂盒货号（CK-E30296R）]；大鼠IFN-γ ELISA检测试剂盒（杭州豪普斯生物有限公司）。
1.1.3 主要试剂 水合氯醛（天津市巴斯夫化工有限公司，每瓶100 g，批号Q/12HB 4218-2013），蒸馏水制作成浓度为10%的水溶液；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美国Sigma公司）；柳氮磺胺吡啶（SASP）（上海信谊嘉华药业有限公司，批号H31020557，每片含0.25 g）；芍药汤由芍药、大黄、黄连、木香、黄芩、槟榔、肉桂、当归、甘草9味药物组成，所用药物均为超微颗粒，由湖南中医药大学第二附属医院提供，并由医院制剂科用蒸馏水制成水剂，每1 mL含生药1.2 g。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及造模方法 按照完全随机设计的方法，分别从20只雄性大鼠及20只雌性大鼠中随机抓取分为4组，每组10只，雌雄各半。除空白组外，其他三组大鼠均按照文献[5-6]复制胃肠湿热模型，将大鼠在普通饲料喂养的基础上饲以高脂高糖饮食，即加用200 g/L蜂蜜水给大鼠自由饮用，隔日按照大鼠体重数量给予10 g/kg的油脂灌服，并油脂隔日按照10 mL/kg灌服白酒，总共10 d，然后放入温度为（32±2）℃、相对湿度为95%的人工气候箱中，共5 d。在已复制的胃肠湿热型模型基础上，采用三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠法制作UC大鼠模型。造模前禁食24 h，然后取SD大鼠，根据大鼠体重，予水合氯醛按照0.4 mL/100 g行腹腔麻醉，麻醉成功后，用大鼠灌胃针头轻轻从插入，切忌用力过猛，避免损伤大鼠肠道黏膜，插入深度为8 cm，然后按照4 mL/kg推入TNBS溶液（含25 mL/L TNBS和500 mL/L 50%乙醇），捏紧大鼠平放5 min即可，术后常规饲养。造模4 d后，从四组各随机抽取1只处死并解剖，游离结肠组织，沿肠系膜方向剪开，生理盐水充分冲洗干净，平铺长肠管组织于试验台进行观察，观察距离肛缘6～10 cm出见肉眼可见溃疡面，病理检查发现炎性改变及典型溃疡面时，即造模成功。
1.2.2 给药方法 于造模成功后第2天开始，芍药汤组大鼠芍药汤剂按照含生药量9.2 g/（kg・d）灌胃，SASP组大鼠按照0.3 g/（kg・d）灌胃，空白组及模型组予等体积的生理盐水灌胃，每天1次，连续2周。
1.3 标本选取
给药14 d后，每组大鼠均禁食24 h，各大鼠分别予水合氯醛按照0.4 mL/100 g行腹腔麻醉，麻醉成功后，腔静脉取血4 mL，高速离心，取上层血清，ELISA法测定血清中细胞因子IL-17、IFN-γ及IL-27水平。
1.4 观察指标
①分别于造模成功后给药前及末次麻醉前观察各组大鼠大便、体重、活动度及精神状态，进行疾病活动指数（DAI）评分，DAI=（体重下降分数+大便性状分数+便血分数）/3，其参照文献[7]进行，积分为0～4分，0分：大便性状正常，无隐血，体重无下降；1分：大便性状正常，大便无隐血，体重下降
1.5 统计学方法
应用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）计算，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 造模结果
造模后各组随机取1只大鼠处死并对其肠道进行观察，除空白组外，其他三组均有肉眼可见的溃疡面；至疗程结束前各组大鼠均存活。
2.2 各组大鼠DAI、CMDI评分比较
模型组DAI评分及CMDI评分明显高于空白组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），芍药汤组治疗后DAI评分及CMDI评分低于模型组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。
2.3 各组大鼠血清中细胞因子IL-17、IFN-γ及IL-27水平比较
与空白组比较，模型组IL-17显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而IFN-γ及IL-27明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，芍药汤组IL-17明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而IFN-γ及IL-27明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
3 讨论
本研究通过在胃肠湿热模型建立基础上，用TNBS制作大鼠UC模型，大鼠出现腹泻及脓血便等症状，且对结肠组织进行大体观察时，见明显充血、水肿、糜烂及溃疡等炎症性肠病的病理变化。UC的发生机制中，免疫反应异常当今被普遍接受并日渐受重视[9-10]。目前相关研究提示，Th1、Th2细胞在炎症性肠病（IBD）的发生中起重要作用[11]。Th17细胞是近来发现的一种不同于Th1、Th2细胞的新的辅T细胞亚群，因其能够特异性分泌IL-17而命名，Th17尚能分泌IL-6、IL-21、IL-22、肿瘤坏死因子（TNF-α）等多种细胞因子[11]，其在炎症性肠病的发病及愈合中起着重要作用[13]。IL-17通过诱导与炎症相关的多个基因的表达（包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、IL-6、细胞间黏附分子1等），增强IL-1及TNF-α诱导的炎性反应，还可通过诱导巨噬细胞产生促炎性细胞因子，建立适应性与先天性免疫的联系[14-15]，在各种组织的炎性反应中发挥重要的调节作用，对于UC的炎症发生起促进作用。目前IL-27与IFN-γ对于IBD的影响尚存争议，有研究认为其具有促炎作用[16-18]，而有研究认为其具有抗炎作用[19]。
UC属于中医学“休息痢”“大瘕泻”等范畴。东汉时期张仲景认为其“下利复发”是“病不尽故也”。隋代巢元方《诸病源候论・卷十七・痢病诸候》认为，休息痢的形成是由于肠胃虚弱，胃管有停饮，冷热气乘之而成。大瘕泻病名首见于《难经・五十七难》：“大瘕泻者，里急后重，数至圊而不能便，茎中痛。”中医对本病的病因病机论述较为详尽。《内经》对其病因的论述，或言风，或言湿，或言寒，或言热，或言清气在下。《诸病源候论》认为病因与外感时邪、内伤饮食、情志失调等有关。如《灵枢・师传》指出：“肠中寒，则肠鸣飨泄。”《素问・阴阳应象大论》曰：“清气在下，则生飨泄。”《素问・太阴阳明篇》：“食饮不节，起居不时，则阴受之。阴受之则人五脏，人五脏则脱满闭塞，下为飧泄，久为肠荨！闭胖倬叭衔该病与热邪有关，其复发是因“病不尽故”及“胃中冷，水别不故也”。以上论述表明，该病病因病机是：外感时邪、起居失常、内伤饮食，或情志失调，而致湿浊邪热郁蒸，胃肠被伤，腑气壅阻，气血凝滞导致发病。针对这一病机，清热燥湿、调和气血为目前中医治疗UC的主要治疗大法。
笔者在临床中使用芍药汤治疗胃肠湿热型UC收效甚佳。该方出《素问・病机气宜保命集》，功擅清热燥湿、调和气血。方中芍药虽非君药，但其用量大，且在本方中养血敛阴，缓急止痛，柔肝泻火，《本草纲目》云其“止下痢腹痛”，相关文献[20-21]有述，芍药有缓解平滑肌痉挛及调节免疫之功效，此即为以其名方之缘由。方中以黄芩、黄连为君，因其清热泻火，解毒燥湿除病因；当归助芍药行血调血，木香、槟榔行气导滞，有云“行血则便脓自愈，调气则后重自除”，四药为臣调和气血；大黄泻热通便，通因通用，肉桂以防苦寒伤中，二药为佐；甘草益胃和中，调和诸药为使；诸药合参，使热得清、湿得化、气血条畅而不乱、肠积得下而不滞，诸症由此得解。
通过本研究发现，芍药汤对大鼠血清中Th17相关细胞因子的影响明显，可以明显降低胃肠湿热型UC大鼠血清中IL-17水平，并且升高其血清中IFN-γ及IL-27的浓度，对胃肠湿热型UC大鼠症状体征的改善作用显著，因此本研究认为芍药汤治疗胃肠湿热型UC可能是通过降低血清IL-17的水平及相应提高IL-27与IFN-γ的浓度来实现的。
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（收稿日期：2015-11-30 本文编辑：张瑜杰）