纺织品纤维定量分析:纤维素酶催化溶解法初探

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摘要：基于酶专一性催化机理，通过纤维素酶对纤维素纤维的选择性降解/溶解过程，本文首次探讨了纤维素酶在纤维素纤维含量检测上的应用前景。以棉贴衬为研究对象，通过单因素试验方案设计，获得了最佳酶催化条件。进一步在最佳催化条件下，通过称重法、SEM、ATR和XRD等手段考察了纤维素酶催化过程中棉贴衬和粘胶贴衬的质量损失曲线，纤维表面形貌、化学组成和结晶结构的变化，并通过对腈纶贴衬、涤纶贴衬和羊毛贴衬的降解试验验证了纤维素酶专一性。初步结果表明，纤维素酶有望应用于纺织品中粘胶纤维含量的检测，为建立新型纺织品纤维定量分析的绿色酶法开辟了新思路。

关键词：纤维含量；定量分析；纤维素酶；酶法检测

1 引言

纺织品中纤维成分含量，是评价纺织品质量的主要指标，也是纺织检测机构业务量占比最大的项目之一。目前使用最为广泛的定量分析方法为化学溶解法[1]，其利用不同纤维成分在溶剂中溶解性的差异，通过溶解去除可溶组分同时不损伤其他纤维（即选择性溶解），进行质量比例分析。委托样品中又以天然纺织原料纤维素纤维如棉、麻、粘胶纤维、莫代尔纤维等居多，与之相关的主要有硫酸法[2]、锌酸钠法[3]、甲酸-氯化锌法[4]等3种。

但是目前化学溶解法测试纤维素纤维含量存在一些问题。以硫酸法为例，它所使用的溶剂为浓度为75%的浓硫酸，具强腐蚀性以及接触皮肤脱水碳化危险，清洗过程中必须保证将硫酸完全去除，否则干燥过程中残留微量硫酸浓度变高就会将残留样品碳化，因此清洗过程需要用大量清水进行冲洗，并用氨水进行中和，气味强烈。硫酸使用量很大，会产生大量有毒有害废水排放，废液处理成本较高，还会腐蚀仪器设备。此外75%硫酸溶液溶解能力强专一性差，可溶解蚕丝、腈纶、锦纶、氨纶、维纶等，使得对三组分及以上纺织样品的含量测定困难。鉴于此，发展一种绿色无害、条件温和、过程简单、溶解专一性好的纤维素纤维含量检测方法十分必要。酶是一种高效生物催化剂，具有很高的催化专一性。同时酶促反应多在常温常压、弱酸弱碱或中性条件下进行，反应溶剂多为水，无腐蚀性。酶的这些特点，使得它在纺织纤维成分的定量检测领域有潜在应用。

纤维素酶Cellulase，编号EC3.2.1.4，是由多种水解酶组成的一个复合酶系，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶，可将纤维素选择性降解成葡萄糖。纤维素酶的降解作用机制，主要有C1―Cx假说、顺序作用假说和协同降解假说，目前普遍认可的是协同作用模型：内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定形区，产生不同长度的寡糖和新链末端；外切葡聚糖酶作用于这些链末端，产生纤维二糖或葡萄糖；葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖[5]。纤维素酶为我国第一大工业酶种，国内年产量在2000吨以上，其用于处理废旧纤维素制品早在上世纪70年代就有报道[6]。目前纤维素酶已广泛应用在纺织品加工领域，如棉麻织物后整理、牛仔布酶洗、织物减量处理、生物抛光等，需要控制降解程度，使得在不损坏纤维强度的前提下，改善纺织品性能。纤维素酶的另一个重要用途就是生物燃料乙醇，利用纤维素酶将生物纤维质如稻草秸秆、玉米秆、木渣等完全降解为葡萄糖后，用于发酵生产[7]。对于纺织品含量检测而言，并不需要将棉、粘胶纤维等完全降解为小分子糖类物质，只需将纤维素成分部分降解为能溶解在水中的寡糖片段，能进行简单分离即可，此工作尚未得到大家关注。

本文利用纤维素酶的专一催化降解特性，首次探讨了其在纤维素纤维含量检测领域的应用前景，并对最佳酶催化条件、酶催化过程及催化专一性等问题进行了系统研究，以期建立一种新型绿色酶法纺织品成分定量分析技术，取代现有危险性有机溶剂浓硫酸的使用。

2 试验部分

2.1 材料

酸性纤维素酶（Primafast 200），由Genencor （Wuxi） Bio-Products Co.， Ltd提供，为复合酶制剂，外观为棕色液体。棉贴衬、粘胶贴衬、腈纶贴衬、涤纶贴衬、羊毛贴衬（满足标准GB/T 7568―2008 《纺织品 色牢度试验 标准贴衬织物》要求）购于杭州天天检科技开发中心。柠檬酸、柠檬酸三钠、醋酸、三水醋酸钠、磷酸氢二钠购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯，直接使用。配制缓冲溶液所用的水为超纯水。

2.2 纤维素酶催化试验

缓冲溶液配制：分别配制pH值为4.8，离子强度为25 mM、50mM、75mM、100mM的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液；pH值为4.8，离子强度为50 mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。当离子强度为50mM，定容到1000mL时，配比分别为柠檬酸4.83g-柠檬酸三钠7.94g，醋酸2.31mL-三水醋酸钠8.16g，柠檬酸5.33g-磷酸氢二钠7.00g。

典型酶催化试验过程：用天平（瑞士梅特勒公司，ME204）称取1.0g贴衬，放入100mL锥形瓶中，然后加入30mL酶溶液，缓冲液为pH值4.8，离子强度50mM的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液，酶量为0.3mL，将锥形瓶放进温度为50℃，转速为50rpm的恒温水浴振荡器中，振荡反应24h后取出抽滤，并用超纯水清洗1次后将残留物放入105℃鼓风干燥箱中干燥完全后称重，根据质量变化计算质量下降率（weight reduction ratio）。在高温干燥过程中，酶会完全失活，不需担心可能的残留酶对织物质量下降率的影响。为保证数据准确性，每批次做两个平行样，取平均值。

通过单因素试验方案设计，分别考察离子强度、缓冲液体系、酶量、浴比、反应温度等参数对酶催化活性的影响，获得最佳条件。在最佳酶催化条件下，得到贴衬质量下降率-时间曲线；以及不同纤维贴衬在纤维素酶催化反应24h后的质量下降率，考察纤维素酶法检测专一性。

2.3 测试表征

表征棉和粘胶贴衬在催化过程中纤维表面形貌、化学组成和结晶结构的变化，具体测试条件如下：

美国Phenom Pro台式扫描电镜SEM，样品预先用导电双面胶固定在样品台上，在10mA电流下喷金30s提高导电性，加速电压设定为5kV，image电子束流，背散射电子（BSE）探测器成分模式（Full）成像，拍摄不同放大倍数的电镜照片。

美国Nicolet 6700型傅立叶红外光谱仪，内反射元件Ge晶体。测试时，样品表面紧贴Ge晶体表面，压紧，选择表面衰减全反射ATR模式，设置扫描精度为2cm-1，扫描次数为32次。

德国Bruke D2 Phaser X射线衍射仪XRD，X射线源为Cu靶，Kα射线，电压30kV，电流10mA，贴衬样品平铺在有机玻璃样品台上，扫描范围为8 o～60o，步长0.02o，扫描速度10o/min，样品台转速15 rpm。

3 结果与讨论

3.1 最适纤维素酶催化条件

棉贴衬为标准物质，性质稳定，数据重现性好，因此以棉贴衬为研究对象，探讨不同参数对酶催化活性的影响，恒温水浴振荡器转速固定为50rpm，反应时间固定为24h，以期得到最适纤维素酶催化条件。

3.1.1 缓冲液体系

首先依据轻工行业标准QB 2583―2003《纤维素酶制剂》附录A滤纸酶活力测定方法中适合酸性纤维素酶的条件，以及公司提供的产品说明书，选取pH值4.8（最适pH）的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，在40℃和50℃下考察离子强度对酶活性的影响，其他条件固定为30mL酶溶液，0.3mL酶量，结果如图1（a）所示。pH值数值的变化不仅影响纤维素酶的活力，还影响酶的稳定性，只有在最适pH值下，酶分子处于最佳的电离状态，因此需要缓冲液具有足够的缓冲容量，以便pH值保持稳定。当离子强度在50mM时，具有最大的酶活力，75mM活力与50mM接近，而离子强度为25mM和100mM时，活性稍差。离子强度为0mM，即仅仅使用超纯水时，酶活性最低，且50℃下的酶活性比40℃低，而在缓冲液体系中，50℃下的酶活性均比40℃高，说明缓冲盐起到了稳定酶结构的作用。

在pH值4.8、离子强度为50mM、反应温度为50℃的情况下，考察缓冲液种类的影响，如图1（b）所示，发现酶活性在不同缓冲液种类中差别不大，超纯水中活性只有缓冲液中一半左右，按如下顺序排列：柠檬酸-柠檬酸三钠>柠檬酸-磷酸氢二钠>醋酸-醋酸钠>超纯水。因此，缓冲液体系确立为pH值4.8，离子强度50mM的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液。

3.1.2 溶液组成

本试验中纤维不溶于水，为典型的非均相催化反应，进一步考察在40℃和50℃下酶量和浴比对酶催化活性的影响。酶溶液总量固定为30mL，酶量影响结果如图2（a）所示。发现50℃下的酶活性均比40℃高，酶量在0.3mL时，贴衬质量下降率最高，这是因为一定量纤维素能和酶分子结合位点数量有限，当这些位点全部被占据后，再增加酶用量，将起不到酶解作用，从经济角度考虑，酶量确定为1.0g贴衬/0.3mL酶量。固定酶量为0.3mL，考察浴比的影响，如图2（b）所示，发现50℃下的酶活性均比40℃高，酶溶液为30mL时，贴衬质量下降率最高。主要有两方面原因，一是酶溶液量少时，会发生产物抑制效应；二是酶溶液量增加时，酶浓度降低，减弱酶向纤维表面的扩散，两方面因素共同作用下，最佳酶溶液添加量确立为1.0g贴衬/0.3mL酶量/30mL酶溶液。

3.1.3 反应温度

最后本文探讨了反应温度的影响，如图3所示，最佳反应温度为50℃。随温度增加，分子运动加速，酶反应还存在活化能，因此在一定温度范围内，反应随温度的升高速度加快。但酶是蛋白质，在一定温度条件下会变性失活，因此当反应温度提高到60℃时，贴衬质量下降率反而从50℃时的25.2%降低到了2.7%。

根据以上试验结果，确定最适纤维素酶催化条件：缓冲液为pH值4.8，离子强度50mM的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液，酶量为0.3mL，酶溶液为30mL，反应温度为50℃。反应24h，棉贴衬的质量下降率在25%左右。在最佳条件下反应24h，粘胶贴衬质量下降率为100%，可完全降解为可溶物。

3.2 酶催化过程研究

在最佳纤维素酶催化条件下，探讨了棉贴衬和粘胶贴衬质量下降率随时间的变化，如图4（a）和（b）所示。棉贴衬质量下降率随着时间延长，呈线性增加趋势，说明此时棉纤维相较酶量一直处于过量状态，酶催化降解速度保持恒定，但催化降解速率较慢，48h后质量下降率才为33.8%。粘胶纤维则不同，4h之后质量下降率就达到了38.6%，16h后为90.7%，24h后已经完成降解为可溶性物质。这主要是由于两者结构不同所致。天然棉纤维中纤维素聚合度在6000～11000之间，结晶度高；而粘胶纤维属再生纤维素纤维，它是以天然纤维素为原料，经碱化、老化、磺化等工序制成可溶性纤维素黄原酸酯，再溶于稀碱液制成粘胶，经湿法纺丝而制成，其纤维素聚合度为500～1000之间，结晶度低。因此纤维素酶对粘胶贴衬表现出了更强的降解能力。

通过SEM、ATR和XRD对降解过程中棉和粘胶贴衬的表面形貌、化学组成和结晶结构变化进行分析。

从图5的SEM图可以发现棉贴衬结构紧密，棉纤维纵向呈扁平的转曲带状，表面略有褶皱；纤维素酶催化24h后，棉贴衬表面断裂纤维增多，纤维表面出现了破碎开孔结构，起到类似剥皮效果；48h后，棉贴衬表面断裂纤维继续增多，纤维表面出现大量的破碎开孔结构，部分纤维已经完全断裂。粘胶贴衬结构紧密，粘胶纤维呈圆形，表面有许多不规则沟槽；8h后粘胶贴衬结构变松散，粘胶纤维分裂为多根细丝；16h后粘胶贴衬已无法看出明显的编织结构，2000x下看，除了多根细丝，还出现了非常多的小碎片。

ATR结果如图6所示，棉贴衬和粘胶贴衬均为典型的纤维素纤维红外谱图，3330cm-1处为O―H基振动峰，2900cm-1处为C―H基振动峰，1650cm-1处是由于水分而引起的吸收峰，在1160cm-1～900cm-1之间的四个峰为―C―O―C―的振动峰，这些峰为纤维素的特征峰[8]。棉贴衬和粘胶贴衬在降解过程中，谱图形状均没有发生变化，说明酶催化降解过程中没有产生新物质或新官能团。贴衬经过酶降解后，O―H峰和―C―O―C―特征峰以及水吸收峰变明显，和SEM结果相对应，说明降解过程中，棉贴衬中纤维素分子组分暴露，同时两种贴衬发生降解，聚合度下降，使得端O―H量增加，吸湿性也增加。

棉贴衬降解过程中纤维素纤维的结晶结构变化结果如图7（a）所示。棉贴衬在2θ为14.90o、16.50o、22.75o、34.26o处出现了4个特征衍射峰，分别对应于纤维素Ι型的（101）、（10ī）、（002）、（040）晶面，说明酶降解过程保持了天然纤维素的Ι型结构[9]。粘胶纤维贴衬因降解后形貌变化较大，因此只测试了未降解样品[图7（b）]，可以发现在2θ在12.25o、19.78o、21.72o处出现了3个特征衍射峰，为纤维素IΙ型结晶结构。通过Bruker EVA软件对结晶度进行半定量分析（表1），可以发现粘胶贴衬的结晶度为31.2%，棉贴衬的结晶度为46.8%，反应24h后结晶度为36.8%，48h后的结晶度为32.5%，说明酶催化降解过程打破了原有的棉天然纤维素结晶结构，使其结晶度降低，但不会改变晶型。

纤维素酶分子由具有催化功能的催化结构域CD、肽连接桥和具有结合纤维素功能的纤维素结合域CBD等三部分组成[10]。结合前人工作基础[5，7，10]，并综合以上试验结果，推测酶催化过程为：由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成复合物的过程，纤维素酶首先特异性地吸附在底物纤维素上，CBD嵌入到纤维素结晶链段区域，使其无定型化，结晶度降低，结晶链段开始溶胀和分散，但不会发生晶型改变以及产生新的官能团；同时各种酶开始协同模式降解，使贴衬质量下降，纤维表面出现了类似剥皮的刻蚀效果；粘胶纤维因有溶解再生的过程，聚合度和结晶度低，因此在24h后可被完全降解完全，棉纤维则随着降解过程的进行，从外向内不断被刻蚀减重。

3.3 专一性分析

混纺织物中不同纤维含量的确定，主要基于“溶解性质”的差异，若在某一溶剂中除目标纤维外其他纤维也会部分溶解，则在计算含量时用不等于1的质量修正值d进行修正，因此对于溶解过程的温度、时间，甚至溶解过程中的手动振荡次数等均有严格要求，容易产生试验偏差。进一步考察了纤维素酶对不同纤维贴衬的催化专一性，结果如表2所示，可以看到，除了对棉和粘胶等纤维素类纤维具有催化降解性能之外，对于羊毛、聚丙烯腈、聚酯等纤维不会产生质量损失，具有优良的催化专一性。将粉碎后的粘胶贴衬和聚酯贴衬按照不同质量配比混匀，进行含量测试，发现测试结果均与投料比吻合。

4 结论与展望

纤维素酶对不同标准贴衬的降解结果表明，纤维素酶有望用于纺织品中粘胶纤维含量的定量检测，但本试验中纤维素酶所需催化降解时间较长，造成检测效率偏低，需对酶及复合酶制剂做进一步筛选。以下问题也有待进一步研究深入：首先是随着纤维素酶活的储存稳定性；其次经过助剂后整理和煮练、印染等过程的面料，其对酶活和降解过程的影响有待探讨；对麻纤维，竹纤维和醋酯纤维的降解能力有待研究；对于其他再生纤维素纤维，如铜氨纤维、莫代尔纤维、天丝纤维等是否具有同样的催化降解效果，还有经过回收处理的再加工纤维，可否利用晶型结构、纤维形貌及纤维素酶催化降解过程差异等进行定性鉴别；基于同样的酶专一性催化降解机理，脂肪酶和蛋白酶是否可用于聚酯类以及蛋白类如羊毛、蚕丝等纤维含量的定量分析。本工作的最终目标是通过纤维素酶、脂肪酶、酰胺酶和蛋白酶等不同酶组合，对纤维素纤维、聚酯纤维、尼龙和蛋白纤维等混纺织物建立一种新型的绿色酶法纺织品成分含量检测技术。

参考文献：

[1] GB/T 2910.1―2009 纺织品 定量化学分析 第1部分：试验通则[S].

[2] GB/T 2910.11―2009 纺织品 定量化学分析 第11部分：纤维素纤维与聚酯纤维的混合物（硫酸法）[S].

[3] GB/T 2910.5―2009 纺织品 定量化学分析 第5部分：粘胶纤维、铜氨纤维或莫代尔纤维与棉的混合物（锌酸钠法）[S].

[4] GB/T 2910.6―2009 纺织品 定量化学分析 第6部分：粘胶纤维、某些铜氨纤维、莫代尔纤维或莱赛尔纤维与棉的混合物（甲酸-氯化锌法）[S].

[5] Valdeir Arantes， Jack N Saddler. Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis： the role of amorphogenesis[J]. Biotecholgy for Biofules， 2010，（3）：4.

[6] Mary Mandels， Lloyd Hontz， John Nystrom.Enzymatic hydrolysis of waste cellulose[J]. Biotechnology and Bioengineering， 1974，105：1471-1493.

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[8] 吴永红，姚中栋.纤维的红外光谱鉴别方法研究[J]. 法医学杂志，1998，（14）：83-84.

[9] 刘治刚，高艳，金华，等. XRD分峰法测定天然纤维素结晶度的研究[J]. 中国测试，2015，（41）：38-41.

[10] Zhang Yi Heng， Lynd Lee. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose： noncomplexed cellulase systems[J].Biotechnology and Bioengineering， 2004，（88）：797-824.

（作者单位：浙江省纺织测试研究院）