RP-HPLC法测定垂盆草胶囊中槲皮素的含量
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(南京中医药大学，江苏南京210029)
摘要：目的：建立一种测定垂盆草胶囊中槲皮素的方法。方法：采用RP－HPLE法，色谱柱为ODS柱，流动相：0.1％三氟乙酸溶液：甲醇(58:42)，检测波长：371nm，柱温：30℃。结果：建立的色谱方法能使槲皮素在5.05-60.6μg/mL范国内。线性关系良好(r=0.9999)，平均回收率100.6％，重现性实验RSD=1.07％(n=6)。结论：本法简便准确可用垂盆草胶囊的含量测定。
关键词：垂盆草胶囊；反相高效液相色谱法；槲皮素；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-0987－02
垂盆草Sedum sarmentosum Bunge为景天科多年生草木植物，分布广泛。它具有清热解毒，抗菌消炎作用。垂盆草胶囊具有清利湿热，降低谷丙转氨酶的作用，临床上用于急性肝炎，迁移性肝炎及慢性肝炎活动期的治疗。化学研究表明，垂盆草含有黄酮及其苷、三萜、甾醇、生物碱、氰苷、氨基酸、糖类等成分。目前垂盆草及其上市的制剂缺少有效的质量控制方法，无法保证成药质量的均一性。黄酮及其苷类化合物是其主要成分之一，本文就拟测定垂盆草胶囊中槲皮素的含量，为制剂的质量控制提供一种思路。
1仪器与试药
Waters Dlta 600高压输液泵，Waters 2487检测器，Wa-ters 600控制器。TU-1800s分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，槲皮素对照品购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用，批号为0081-9304)。甲醇色谱纯(淮阴汉邦科技有限公司)，三氟乙酸为色谱纯(Tedia com-pany)，水为去离子水。垂盆草由黄山龙源药业提供，垂盆草胶囊为实验室自制。
2方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验 色谱柱；Kromasil：ODSC18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇：0.1％三氟乙酸水溶液(42:58)；流速：1.0mL/min；检测波长：371nm；柱温：30℃；进样量：5μL。在该条件下槲皮素和其他干扰成分能够得到较好的分离，按槲皮素峰计算理论塔板数应不低于2000。
2.2对照品纯度试验 取槲皮素对照品适量，加甲醇制成0.1mg/mL的对照品溶液。精密吸取槲皮素对照品溶液5μL，照高效液相色谱法(2005年版《中国药典》一部附录)测定，将保留时间延长1倍和缩短1倍未见有杂质峰出现。
2.3标准曲线绘制 取于60℃真空干燥至恒重的槲皮素对照品适量，精密称定，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成槲皮素标准贮备液(0.101mg/mL)。再分别精密移取0.5、1、2、3、4、5、6mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成系列对照品液，分别吸取上述溶液5μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度(μg/mL)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=94131X-23497(r=0.9999)槲皮素浓度在5.05-60.6μg/mL之间呈良好的线性关系。
2.4精密度考察 精密吸取槲皮素对照品溶液5μL，重复进样6次，测定，结果槲皮素峰面积的RSD=0.56％。
2.5重现性试验 取同一批样品，精密称取6份，按样品含量测定方法提取、分析，结果槲皮素峰面积的RSD=1.07％。
2.6稳定性试验 将制备好的供试品溶液进行进样分析，以后每2h进样1次，测定6次，槲皮素含量的RSD=0.60％，表明供试品溶液的含量在10h内稳定。2.7 回收率测定精密称取同一批垂盆草胶囊内容物各1.5g共6份，2份1组，各组分别加入了槲皮素对照液(1.01mg/mL)1.28、1.60、1.92mL。各份均依样品测定方法操作。结果槲皮素平均回收率为100.6％。RSD=0.94％。
2.8样品测定 取本品装量差异项下内容物，研细，取粉末1.5g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加入60％甲醇50mL，称重，超声提取30min(超声功率为250W，频率为50kHz)，放冷，补足失重，摇匀后过滤，精密量取续滤液25mL，加入25％盐酸(g/g)6mL水浴回流水解60min，快速冷却，转移至50mL量瓶中，加入25％氢氧化钠4mL，冷却，60％甲醇定容至刻度，摇匀，取样过膜，即得。
精密吸取槲皮素对照品溶液、供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。
3.1波长的选择 槲皮素属于黄酮醇类化合物，在溶剂甲醇中带Ⅱ苯甲酰系统的吸收峰是255nm，带Ⅰ桂皮酰系统的吸收峰是371nm，紫外光谱显示在371nm处吸收较强，且在该波长下基线的噪音小、检测灵敏度度高，因此选择371nm作为检测波长。
3.2流动相的选择 本实验涉及到的色谱分离主要是一些黄酮类化合物，因此必须选择酸性流动相，主要是使被分离物保持单一的分子态进行色谱分离。酸性试剂的选择上，采用色谱纯的三氟乙酸，与常用的磷酸及其缓冲盐比较存在较大优势。三氟乙酸为中等强度的挥发性有机酸，可以适用于较大的酸性范围，不会在高压输液泵和色谱柱内残留，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，此外还具有一定的离子对试剂样作用。
3.3样品处理方法的选择 实验中，曾将样品超声提取后直接过膜进样，发现样品中槲皮素的含量非常的微量，经酸水解后，发现槲皮素基本上是以糖苷的形式存在的。因此样品处理中采用先提取再水解的方式。
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