耐甲氧西林葡萄球菌常规检测方法的比较

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇耐甲氧西林葡萄球菌常规检测方法的比较范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：目的 比较三种方法对耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的阳性检出率和特异性，寻找适合实验室常规检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）简易，准确的方法。方法 通过头孢西丁（30μg/片）纸片扩散法、苯唑西林（1μg/片）纸片扩散法和苯唑西林琼脂筛选法对临床分离的67株葡萄球菌进行MRS检测，比较其MRS检出率，为分析NaCl对头孢西丁和苯唑西林纸片扩散法检测结果的影响，同时用含4%NaCl的M-H培养基和普通M-H培养基进行检测，比较其差异。结果 67株葡萄球菌中琼脂筛选法检出率为79.1%；头孢西丁纸片扩散法在含4%NaCl和普通M-H培养基检出率相同，均为71.6%，苯唑西林（1μg/片）纸片扩散法在含4%NaCl的M-H培养基检出率为76.1%，普通M-H培养基检出率为73.1%，苯唑西林纸片法在含4%NaClM-H培养基上的检出率高于普通M-H培养基，分别各有1株金葡和凝固酶阴性葡萄球菌未被检出。结论 头孢西丁（30μg/片）纸片扩散法与苯唑西林琼脂筛选法具有很好的相关性，且不受NaCl影响，该法操作简便易行，各医院临床实验室均能开展，是检测MRS值得推荐的方法。

关键词：耐甲氧西林葡萄球菌；头孢西丁纸片扩散法；苯唑西林琼脂筛选法；mecA基因

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1菌株 2012年3月～11月从本院检验科临床标本分离到的葡萄球菌67株，其中金黄色葡萄球菌（SA）31株，凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）36株，保存于-20℃低温冰箱，实验前转种于5%脱纤维羊血培养基备用，参考菌株：ATCC25923为MRS阴性及药敏试验质控菌株，ATCC43300为MRS阳性质控菌株。均由云南省临床检验中心提供。

1.1.2试剂和材料 药敏纸片：头孢西丁（30μg/片，批号：2001210）、苯唑西林（1μg/片，批号：201209），北京天坛生物技术开发公司生产；苯唑西林标准品，山东瑞阳制药有限公司生产；批号：12030814；M-H培养基，杭州天和微生物试剂有限公司生产；批号：120422；MRS琼脂筛选培养基：配制M-H琼脂培养基（OXAID公司产品；批号：201212），加入NaCl使其浓度达4%，经高压灭菌，冷却至50℃时加入苯唑西林，使其最终浓度为6μg/ml，倾注培养基。金葡萄菌乳胶凝集诊断试剂盒Staph Slidex-kit，法国生物梅里埃公司产品，批号：73115。

1.2.方法

1.2.1 菌种鉴定 临床标本按常规进行分离培养，对所有分离到的葡萄球菌用金葡萄菌乳胶凝集诊断试剂盒Staph Slidex-kit进行鉴定。

1.2.2 菌液制备 按NCCLS标准进行，挑取孵育18～24h的单个菌落以生理盐水稀释至0.5麦氏单位比浊标准备用。

1.2.3头孢西丁（30ug/片）纸片扩散法：取0.5麦氏单位菌液均匀涂布于含4%NaClM-H培养基和普通M-H培养基，贴30μg/片头孢西丁药敏纸片35℃24h观察结果（CNS孵育48h），SA抑菌圈直径≤21mm，报苯唑西林耐药，CNS抑菌圈直径≤24mm，报苯唑西林耐药。质控菌株为SA ATCC 25923。

1.2.4苯唑西林纸片扩散法 将0.5麦氏单位的菌液均匀涂布于含4%NaClM-H培养基和普通M-H培养基，贴1μg/片苯唑西林药敏纸片35℃24h观察结果（CNS孵育48h），SA抑菌圈直径≤10mm为耐药，SA抑菌圈直径在11～12mm为中介，SA抑菌圈直径≥13为敏感，CNS抑菌圈直径≤17mm为耐药，CNS抑菌圈直径≥18mm为敏感。质控菌株为SA ATCC 25923。

1.2.5 苯唑西林琼脂筛选法 制备含6μg/ml苯唑西林、4%NaCl的筛选M-H琼脂培养基，将校正过的0.5麦氏单位菌液点种于上述培养基上，SA35℃孵育24h，CNS48h观察结果。在此平板上只要有一个菌落生长即判断为MRS，不生长的为甲氧西林敏感葡萄球菌（MSS）。质控菌株为ATCC 43300。

2结果

2.1 67株葡萄球菌中乳胶凝集实验凝集有31株，定性为金黄色葡萄球菌。33株葡萄球菌中乳胶凝集实验阴性，定性为凝固酶阴性葡萄球菌。

2.4 三种方法对MRS的检出结果比较 从实验结果看，三种方法对MRS的检出率具有较高的符合率，分别为头孢西丁纸片法71.6%、苯唑西林纸片法76.1%（4%NaClM-H），73.1%（普通M-H）、琼脂筛选法79.1%。其中头孢西丁纸片法在4%NaClM-H和普通M-H上检出结果相同。但几种方法的检测结果也存在差异，苯唑西林纸片法在含4%NaClM-H培养基上的检出率高于普通M-H培养基，分别各有1株金葡和凝固酶阴性葡萄球菌未被检出，此外，在普通M-H培养基上有一例SA抑菌圈直径处于药敏判断中介，无法判断是否为MRSA。头孢西丁纸片法比苯唑西林琼脂筛选法少检出5株MRS，在含4%NaClM-H培养基上，头孢西丁纸片法比苯唑西林纸片法少检出5株MRS，在普通M-H培养基上比苯唑西林纸片法少检出3株MRS。

3 讨论

葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素耐药机理[1]主要有以下几个方面：①由染色体mecA基因大量表达一种特殊青酶素结合蛋白（PBP2a），这种蛋白存在细胞表面，对β-内酰胺类抗生素具有极低的亲和力，使MRSA很少或不能与β-内酰胺类抗生素结合，从而产生耐药。②产生大量β-内酰胺酶，缓慢水解β-内酰胺抗生素。③细菌产生PBP2a之外的其它过量PBPs。MRSA产生的最主要原因为产生mecA编码的PBP2a，不利于mecA基因表达的外界条件可使传统的药敏试验出现假阴性[2]，从所做实验看来，在M-H培养基中加入4%NaCl，孵育温度35℃，结果头孢西丁纸片法阳性的48株葡萄球菌在琼脂筛选法上均显示耐药，苯唑西林纸片扩散法阳性的51株葡萄球菌在琼脂筛选法上也显示耐药，并且苯唑西林纸片扩散法在加4%NaClM-H培养基比普通M-H培养基多检出2例MRSA，还未出现普通M-H培养基SA抑菌圈处于中度敏感，无法判断结果的情况（普通M-H培养其中有1例SA抑菌圈直径处于中度敏感）。提示上述条件有利于mecA基因表达，克服葡萄球菌生长不均一的耐药特点，从而提高表型检测的敏感性。耐药的不均一性也是表型检测造成假阴性的因素[2]。葡萄球菌的耐甲氧西林不均一性和mecA基因转录调节因子mecR1、mecI等有关。观察K-B扩散法时应注意抑菌圈内是否有单个菌落或雾状生长，凡抑菌圈内出现散在菌落者均视为MRS菌株。就我们所做实验的观察而言，加4%NaClM-H培养基药敏实验抑菌环明显小于不含盐者，易于观察测量抑菌圈直径，若不仔细观察普通培养基易发生假阴性结果。

mecA基因检测被视为对MRS检测的一种"金标准"，但受设备、仪器试剂、人员素质和费用的限制，不易在各医院临床实验室普遍开展。本文根据NCCLS2013年1月用30ug/片头孢西丁检测mecA介导苯唑西林耐药金黄色葡萄球菌，用头孢西丁纸片扩散法对67株葡萄球菌与以前推荐常规表型检测法进行比较评价，结果头孢西丁纸片扩散法阳性的48株葡萄球菌在苯唑西林琼脂筛选法上均显示耐药，符合率为91%（48/53），说明头孢西丁纸片扩散法与苯唑西林琼脂筛选有很好的相关性，并且头孢西丁纸片扩散法药敏实验判断标准不存在中介结果，克服了苯唑西林纸片扩散法检测中，葡萄球菌抑菌圈为中介需做苯唑西林MIC来判断的问题，且该法操作简便，设备简单，各级医院临床实验室均能开展，是检测MRS值得推荐的方法。

本文苯唑西林琼脂筛选法比头孢西丁纸片扩散法多检出5株MRSA，因受条件所限，本次实验无法运用PCR检测mecA，所以无法判断这5株葡萄球菌mecA的存在与否，但根据NCCLS推荐头孢西丁检测MRSA的原因："用30ug/片头孢西丁检测对葡萄球菌做药敏实验能预报mecA介导的MRSA耐药[3]"，且参考相关论文头孢西丁纸片扩散法与多重聚合酶链反应检测耐甲氧西林葡萄球菌的mecA符合率为100%，所以推测这5株葡萄球菌可能为mecA阴性，其耐药原因可能为β-内酰胺酶的大量产生，或存在PBP2a之外的低亲和力PBP有关，这5株葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺类酶的联合抑制剂仍然敏感，预示可选用毒副作用比万古霉素低的其它抗生素。这正是NCCLS推出头孢西丁检测MRSA的理由：头孢西丁代替苯唑西林检测mecA介导的MRSA，可提高MRS检测的特异性。从而减少了非mecA基因介导的假MRSA，临床医生对这类感染的治疗也更有针对性。

参考文献：

[1] 郑波，李家泰.多重聚合酶链反应检测耐甲氧西林葡萄球菌[J].中华医学检验杂志，1999；22（3）：145.

[2] 洪秀华，唐毅，毛向群，等.耐甲氧西林葡萄球菌四种方法比较及临床应用[J].上海医学检验杂志，1999，14（4）203.

[3] 陈民均.美国临床实验室标准化委员会2004年版有关药敏实验标准化更新要点[J].中华医学检验杂志，2004；27（3）：608.编辑/王海静