白胡椒总生物碱的体外抗肿瘤作用研究
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摘要：目的 研究白胡椒总生物碱对体外培养的肿瘤细胞株生长与集落形成的抑制影响。方法 白胡椒总生物碱用80%的乙醇进行索氏提取，再用大孔树脂进行纯化，用三氯甲烷萃取得到。采用四甲基噻唑蓝（MTT）法和细胞集落计数法检测生物碱对体外培养的SWWC116癌细胞、NCI-446癌细胞和Hela癌细胞的集落形成与生长的抑制作用。结果 白胡椒总生物碱显著抑制了SWWC116细胞和Hela细胞的集落形成和生长，抑制生长的IC50值分别为1.8mg/L和10mg/L，抑制集落形成的IC50值分别为0.3mg/L和0.9mg/L。而对NCI-446细胞的集落形成和生长无显著性抑制。结论 白胡椒生物碱对体外培养的两种癌细胞具有显著的抑制作用。
关键词：白胡椒；总生物碱；集落形成法；MTT法
中图分类号：R285.5 文献标识码：B
Abstract：Objective To test the antitumor activity of alkaloids from white pepper on NCI-446， SWWC116， Hela tumor cells in vitro. Methods In vitro study on the pharmacological activity of alkaloids from white pepper were performed by using MTT assay and Colony-forming assay. Results The result showed that alkaloids from White pepper had inhibition activity against Hela and SWWC116 tumor cell etc. Conclusion Alkaloids from white pepper has antitumor activity.
Key words：White pepper；Antitumer activitiey；Aalkaloids
白胡椒为胡椒科植物胡椒（Piper nigrum L）的成熟的果实。原产地为东南亚，在我国得主要产区在海南省，是海南省的特色农产品之一[1]。在华南地区、云南省和台湾省也有栽培。白胡椒为药食两用植物。在食品领域，白胡椒是优良的调味剂，还具有食品天然防腐剂的作用，被广泛用作腌制品的防腐性香料。在医药领域，白胡椒具有调热、健胃、利尿及支气管黏膜刺激等作用，可治疗消化不良、积食、寒痰、肠炎、感冒、支气管炎和风湿病等[2]。最近的研究表明，白胡椒在抗炎、抗惊厥、杀虫镇痛、镇静、和抗癌等多方面存在活性[3，4]。为了探讨白胡椒生物碱的抗癌作用，本实验对白胡椒总生物碱进行体外抗肿瘤研究。现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1材料 实验用白胡椒产地海南。人大肠癌细胞SWWC116、人肺腺癌细胞NCI-446和人宫颈癌细胞Hela均由吉林省肿瘤医院提供。
1.2试剂与仪器 MTT试剂由德国Sigma公司提供；胚胎牛血清（FBS）由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；胰蛋白酶由天津市景洋生物制品有限责任公司提供；RPMI-1640培养基由美国GIBCO公司提供；二甲基亚砜（DMSO）、乙醇、三氯甲烷等均为国产分析纯试剂。D106型大孔吸附性树脂为工业品。
FZ102型微型植物粉碎机，主要仪器设备有MP2002型电子分析天平，KQ3200V型超声波清洗器，SHZ-D型循环水多用真空泵，RE-52型旋转蒸发仪，752型紫外分光光度计，SHELLAB型CO2培养箱，BIOCELL酶标仪，OLYMPUS倒置显微镜等。
1.3生物碱的提取分离方法[5] 将白胡椒粉碎，过100目筛。称取10 g于1000mL圆底烧瓶中，加90%乙醇200ml，在90℃回流提取2h，抽滤后收集滤液。残渣加入150ml 80%乙醇重复提取1次，过滤后弃去残渣，合并2次滤液，用D106大孔吸附树脂吸附，60%乙醇洗脱（流速2～3ml/s）。用旋转蒸发器回收洗脱液中的乙醇，浓缩至50ml，加0.5% 盐酸调pH至2～3后抽滤。滤液用1倍体积的三氯甲烷萃取2次，弃去三氯甲烷层，合并水层。加0.5%的NaOH调pH至7左右，抽滤后除去鞣质，继续加0.5%的NaOH调pH至9～11，用100ml三氯甲烷萃取3次，弃去水层，合并三氯甲烷相。回收得到的三氯甲烷部分经浓缩，真空干燥，备用。
1.4肿瘤细胞的培养方法[6] 取-15℃冷冻保存的3种癌细胞于37℃水浴中解冻，加培养液稀释后，1000r/min的速度离心5分钟，接种于500ml细胞培养瓶中，37℃、5% CO2条件下培养过夜，换液，待细胞覆盖瓶底的70%左右时，经0.25%的胰蛋白酶进行消化，传代培养。
1.5 MTT法检测细胞生长[7，8] 取数生长期的3种肿瘤细胞，各自用RPMI-1640培养基（含10%牛胚胎血清）调配成浓度为5×104细胞/mL的细胞培养液，接种于96孔板中，每孔加100μL细胞培养液。5% CO2、在37℃培养箱中培养24h，吸取上清，加含白胡椒生物碱的培养基（浓度为0.01，0.1，1，10，100g/L）200μL，每个浓度设置5个平行样，并设置5个空白对照样，空白对照里加培养基200μL。在37℃、5% CO2条件下培养48h，弃去培养基，每孔加入180μL培养基（不含血清）和20μL 5mg/ml的MTT。37℃条件下培养4h，用酶标仪检测630nm处的吸光度。按下列公式计算细胞生长抑制率，重复3次。抑制率=（A对照组-A药物组）/A对照组×100%
1.6集落形成抑制作用的检测方法 用0.5ml、0.25%的胰蛋白酶消化对数生长期的癌细胞，计数，用RPMI-1640培养基（含10%牛胚胎血清）调配成浓度为200细胞/ mL的培养液，接种于24孔板，每孔加入1ml培养液，其中包含900μL癌细胞培养液和100μL白胡椒生物碱培养液，设5个不同的浓度梯度，终浓度为0.01，0.1，1，10和100g/L，每种浓度设5个平行样，5个对照孔里各加入900μL癌细胞培养液和100μL不含生物碱的培养基，置5% CO2、37℃条件培养7d。吸取上清液，细胞集落用瑞氏染液染色5min，用Sorensen磷钼酸缓冲液和Giemsa's溶液以9∶1混合后再染色5min。流水冲洗，凉干，用显微镜计数含50个细胞以上的集落，重复3次。按下列公式计算集落形成的抑制率。集落形成抑制率（%）=1-细胞集落数/对照组集落数×100%
2 结果
2.1白胡椒生物碱对体外培养的3种癌细胞生长的影响：MTT法具有良好的稳定性和灵敏度，可评价性高、测定结果客观及操作简单等优点，广泛应用于药物筛选和医学及生物学领域的研究中[8]。本论文利用该方法观察了白胡椒生物碱对3种体外培养的癌细胞生长的抑制作用。从图1可看出，白胡椒总生物碱显著抑制了SWWC116细胞和Hela细胞的生长，并具有剂量依存关系，其达到50%抑制率所需的药物浓度（IC50值）分别为10mg/L和1.8mg/L。对NCI-446细胞生长的抑制率虽然较低，但具有明显的剂量依存关系。
图1 白胡椒总生物碱对不同肿瘤细胞生长的抑制曲线
注：与空白对照组比较，**P
2.2白胡椒生物碱对体外培养的3种癌细胞集落形成的抑制作用：计数集落形成的方法能反映单个细胞的增殖能力，通过集落计数能较灵敏地测定药物的抗癌活性，目前被认为是一种较理想的检测方法[9]。图2为白胡椒总生物碱对SWWC116、NCI-446和Hela细胞株集落形成的影响。从图2可看出，白胡椒总生物碱对3种肿瘤细胞的集落形成均有抑制作用，且抑制率与浓度成正比。其对Hela和SWWC116细胞集落形成的抑制作用非常明显，达到50%抑制率所需浓度IC50值分别为0.9mg/L 和.3mg/L。在本实验条件下无法得到对NCI-446细胞集落抑制的IC50值。
3 讨论
胡椒碱是胡椒中主要的活性化学物质，属于桂皮酞胺类生物碱。目前已发现胡椒碱具免疫调节、抗肿瘤、有抗氧化以及促进药物代谢等作用[10～14]。
用体外试验的方法筛选抗肿瘤药物时，药物的50%致死率小于10mg/L，且呈剂量依存性，该药被认为有抗肿瘤活性[15]。白胡椒生物碱显著抑制Hela细胞和SWWC116细胞的生长，且IC50值分别为1.8mg/L、10mg/L，对细胞集落形成抑制的IC50值分别为0.3mg/L和0.9mg/L，并具有剂量依存型。因此，白胡椒总生物碱对2种体外培养的癌细胞具有非常显著的抑制作用，具有进一步研究和开发价值。但白胡椒生物碱中主要有哪些活性具有抗肿瘤作用不是很清楚。因此，在今后的研究中一方面采用GC-MS或者HPLC-MS对白胡椒主要的抗肿瘤活性成分进行定性定量分析，另一方面加强对白胡椒抗肿瘤活性物质的应用研究，在进行进一步的分离纯化的基础上，应用到人畜肿瘤治疗中去。
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