小檗碱对脂肪胰岛素抵抗细胞PPARγ及脂肪分泌因子表达的影响

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[摘要] 脂肪分泌细胞因子与脂肪组织胰岛素抵抗（IR）密切相关，在糖尿病的发生发展研究中越来越受到重视。该实验主要研究小檗碱对脂肪胰岛素抵抗（IR）细胞pparγ和脂肪分泌因子mRNA表达的影响，探讨小檗碱增强胰岛素敏感性的分子机制及微滴数字PCR（ddPCR）方法的应用优势。该实验采用ddPCR绝对定量分析简单直观确定合适的内参基因，ddPCR和荧光定量法（qPCR）方法比较研究不同剂量（10，20，50，100 μmol・L-1）小檗碱干预IR 3T3-L1脂肪细胞中PPARγ、脂联素、抵抗素和瘦素mRNA表达；加入GW9662研究PPARγ和脂联素mRNA表达的内在关联。ddPCR结果发现β-actin 在脂肪细胞中表达稳定，适合作为内参基因对定量PCR数据标准化。ddPCR和qPCR方法均显示与IR模型组相比，10，20，50，100 μmol・L-1小檗碱呈现剂量依赖降低脂联素mRNA表达（P

[关键词]小檗碱； 胰岛素抵抗； PPARγ； 脂肪细胞因子； 微滴数字PCR（ddPCR）

[Abstract] Adipocytokines are closely associated with insulin resistance （IR） in adipose tissues， and they are more and more seriously taken in the study of the development of diabetes. This experiment was mainly to study the effect of berberine on mRNA expression levels of PPARγ and adipocytokines in insulin resistant adipocytes， and investigate the molecular mechanism of berberine in enhancing insulin sensitization and application advantages of droplet digital PCR （ddPCR）. ddPCR absolute quantification analysis was taken in this experiment to simply and intuitively determine the appropriate reference genes. ddPCR and quantitative Real-time PCR （qPCR） were used to compare the effect of different doses of berberine （10， 20， 50， 100 μmol・L-1） on mRNA expression levels of PPARγ， adiponectin， resistin and leptin in IR 3T3-L1adipocytes. Antagonist GW9662 was added to study the inherent correlation between PPARγ and adiponectin mRNA expression levels. ddPCR results showed that the expression level of β-actin in adipocytes was stable， and suitable as reference gene for normalization of quantitative PCR data. Both of ddPCR and qPCR results showed that， as compared with IR models， the mRNA expression levels of adiponectin were decreased in the treatment with berberine （10， 20， 50， 100 μmol・L-1） in a dose-dependent manner （P

[Key words] berberine； insulin resistance； PPARγ； adipocytokines； droplet digital PCR （ddPCR）

doi：10.4268/cjcmm20161103

近年来临床调查发现我国18岁以上糖尿病患者多达1.139亿[1]，控制血糖是防治糖尿病的关键。中药临床辨证治疗，黄连为主要的系列经方广泛用于糖尿病发生发展和不同阶段。小檗碱是从黄连中分离出的一种异喹啉生物碱，临床研究显示小檗碱能显著降低糖尿病患者的体重和血糖血脂及炎症因子，提高脂联素浓度，降低瘦素水平，改善胰岛素抵抗（IR），疗效显著且安全性较高[2-3]。动物实验研究表明小檗碱能提高胰岛素受体的表达、促进糖酵解、增强胰岛素敏感性、促进胰岛素的释放与分泌，具有良好的降糖效果[4-5]。小檗碱改善IR的机制研究有助于指导其在糖尿病上的临床用药。本实验摸索建立稳定可靠的IR模型，确认各剂量小檗碱降糖药效的基础上对不同剂量小檗碱对IR脂肪细胞PPARγ及脂肪分泌因子mRNA表达进行研究。考虑到瘦素和抵抗素的低丰度表达，本实验采用最新的微滴数字PCR （ddPCR）和荧光定量（qPCR）方法，比较检测不同剂量干预下各组PPARγ和脂肪分泌因子mRNA表达变化差异。

1 材料

Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪，ABI 7500型Real-time PCR仪（美国Thermofisher公司）；QX200微滴式数字PCR系统（美国Bio-Rad公司）；Eppendorf 5424R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Spectra Max Plus384全波长酶标仪（美国 Molecular Devices公司）。

盐酸小檗碱（中国食品药品检定研究院，批号110713-201212）；罗格列酮，GW9662，地塞米松，IBMX和胰岛素购自Sigma公司（批号分别为122320-73-4，BGBC1877V，D8040，STBC7632V，I5500）；TNF-α（Protech公司，批号070473）；高糖DMEM（Hyclone公司，批号1280）；新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号140625）；胎牛血清（全式金生物科技有限公司，批号G20701）；Trizol和PureLinkTMRNA Mini Kit （ Life Technologies公司，批号分别为74121，1502889A）；GoScriptTMReverse Transcription System （Promega公司，批号000013889）；DNase-free water （Qiagen公司，批号129115）；Power SYBR Green PCR Master Mix和Taqman Gene Expression PCR Master Mix，FAM标记探针引物PPARγ，脂联素，抵抗素，瘦素，β-actin，GAPDH，α-tubulin购自Life Technologies 公司（批号分别为1408467，1402193，1272571，1270795，1279888，1390158，1274427， 1293520， P140417-001A10）；ddPCRTMSupermix for Probes和droplet generation oil for Probes购自Bio-Rad公司（批号分别为186-3010，186-3005）。

3T3-L1 细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）由中国科学院细胞库提供。

2 方法

2.1 3T3-L1细胞培养 按照参考文献[6]方法，将处于对数生长期的细胞消化后，用含10%新生牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度为6×107个/L，接种在24孔板上，每孔接种1 mL。待细胞生长至完全融合，将培养液换成含10%胎牛血清、0.5 mmol・L-1 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、10 mg・L-1胰岛素、1.0 μmol・L-1地塞米松和2 μmol・L-1罗格列酮的高糖DMEM培养基，3 d后换用10 mg・L-1胰岛素、10%胎牛血清的高糖DMEM培养2 d，之后每2 d换用含10%胎牛血清的高糖DMEM，诱导分化10 d左右的3T3-L1细胞90%呈脂肪细胞表型，细胞内可见明显脂滴，油红O染色法鉴定[6]。

2.2 IR模型制备及给药方法 将分化诱导成功后的脂肪细胞分为对照组和模型组，对照组加正常培养基，模型组加入含1.0 μmol・L-1地塞米松的培养基，用葡萄糖测定试剂盒检测诱导24，48，72，84，96 h细胞外液中的葡萄糖量，选择正常组和模型组细胞葡萄糖消耗差值最大的时间为诱导最佳建模时间，并进行后续给药实验。

2.3 给药分组及药效试验 将分化成熟的脂肪细胞分为9组，分别是空白组，模型组（IR组），10，20，50，100 μmol・L-1小檗碱组、罗格列酮组、罗格列酮+GW9662组、小檗碱+GW9662组，每组6孔，预防性给药。空白组给予完全培养基，模型组及给药组给予含有20 μg・L-1 TNF-α完全培养基，除此之外，罗格列酮组含10 μmol・L-1罗格列酮，小檗碱各组分别含有10，20，50，100 μmol・L-1小檗碱，罗格列酮+GW9662组添加10 μmol・L-1罗格列酮和10 μmol・L-1 GW9662，小檗碱+GW9662组添加10 μmol・L-1小檗碱和10 μmol・L-1 GW9662。给药作用48 h后，用葡萄糖测定试剂盒检测各组细胞外液中的葡萄糖量。

2.4 RNA提取和RT收集 各组细胞按PureLinkTMRNA Mini Kit说明书提取总RNA。RNA浓度及纯度用Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪检测，确保吸光度在1.9～2.0。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。Promega逆转录试剂盒合成cDNA。

2.5 微滴式数字PCR（ddPCR） 数字PCR的反应体系：2×ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，模板DNA 1 μL，20×Prime Probe mixture 1 μL，DNase-free water 8 μL。将配制好的20 μL PCR反应液，转移至微滴发生卡（DG8 cartridge）中，再加入70 μL微滴发生油（droplet generation oil）后，利用QX200TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴。数字PCR循环反应条件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 45 s， 68 ℃ 45个循环； 98 ℃，10 min， 4 ℃。将PCR扩增后的96孔板放入QX200TMddPCR仪的微滴分析器中，并在软件QuantaSoft上设定检测模式为ABS（absolute quantification），检测FAM的荧光信号。仪器会自动分析每个微滴中荧光信号，然后计算各样品基因拷贝数浓度。

2.6 荧光探针定量PCR法（Taqman-qPCR） 荧光探针PCR采用20 μL的PCR反应体系：Taqman Gene Expression PCR Master Mix10 μL，模板DNA 1 μL，20×Prime Probe mixture 1 μL，DNase-free water 8 μL。DNase-free water 9.4 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s， 68 ℃ 30 s， 40个循环。以内参基因β-actin为参照，计算目标样本基因相对含量。用于ddPCR和qPCR的商业化Taqman引物购自美国Life Technologies公司。

2.7 数据统计分析 所有数据以±s表示，采用SPSS 19.0 统计分析软件分析数据。多组间的比较用One-way AVONA方差分析， 2组组间比较采用非配对t检验；P

3 结果

3.1 3T3-L1脂肪细胞的分化 3T3-L1前脂肪细胞成长梭状，胞浆内无脂肪小滴。当生长到接触抑制后，加罗格列酮诱导4 d细胞开始变圆，出现少量小脂滴。当诱导到8～9 d时，90%左右的细胞表现为有大量脂滴的圆形细胞，符合脂肪细胞特征， 油红染色鉴定前脂细胞已分化为脂肪细胞（图1）。

3.2 IR脂肪细胞模型的建立及诱导时间优化 采用地塞米松加罗格列酮诱导的方法建立脂肪IR细胞模型。检测不同时间点细胞外液葡萄糖含量，结果显示，24 h已建立起IR脂肪细胞模型，一直持续到96 h，但对于正常组而言，96 h细胞外液营养物质缺乏影响脂肪细胞的正常生长增殖，所以认为稳定IR模型建立的时间应为24～84 h（表1）。

3.3 不同剂量小檗碱的降糖药效检测 采用不同剂量小檗碱干预地塞米松加罗格列酮诱导建立脂肪IR细胞48 h，检测细胞外液葡萄糖含量。结果显示与IR模型组相比，各个剂量（10，20，50，100 μmol・L-1）小檗碱都显著降低细胞外液葡萄糖浓度，具有显著降糖药效（表2）。

3.4 基于数字探针PCR法确定合适内参基因 采用新一代ddPCR探针法基于绝对定量原理研究正常组，IR组和阳性药物组内参候选基因β-actin， GAPDH和α-tubulin之间比值变化。GAPDH与β-actin均以α-tubulin进行校正，当α-tubulin恒定表达时，β-actin在各组脂肪细胞样本中的表达量较为稳定，适合做内参基因；当β-actin进行校正，α-tubulin在各处理样本中的表达量较为稳定，而GAPDH在各组样本中数值离散，差异变化大，表明GAPDH不适合在IR脂肪细胞中作为内参基因进行标准化分析（图2）。

3.5 基于qPCR和ddPCR方法比较研究小檗碱对PPARγ和脂联素基因表达的影响 基于qPCR法和ddPCR法获得小檗碱干预脂联素mRNA表达的结果类似（图3），与正常组比较，IR模型组脂联素表达下降（与qPCR和ddPCR，P

3.6 拮抗研究PPARγ基因和脂联素基因表达关联性 在前2个实验结果基础上，加入PPARγ特异拮抗剂GW9662后检测PPARγ和脂联素mRNA表达（表3，4）。与非拮抗组相比，小檗碱拮抗组均显著下调脂联罗格列酮拮抗组均非常显著下调脂联素mRNA表达，揭示脂联素mRNA表达主要受PPARγ调控。

3.7 ddPCR检测IR脂肪细胞抵抗素和瘦素基因表达 ddPCR检测IR脂肪细胞抵抗素和瘦素mRNA表达结果类似，与正常组比较，模型组抵抗素和瘦素表达下降（P

3.8 小檗碱剂量依赖性干预mRNA表达研究 10，20，50，100 μmol・L-1多个剂量小檗碱用来干预IR脂肪细胞。qPCR和ddPCR均检测到小檗碱剂量依赖降低PPARγ mRNA表达，但两者存在细节上小差异；qPCR结果显示20，50，100 μmol・L-1小檗碱下调PPARγ 均呈现非常显著差异（P

不同剂量小檗碱干预下脂联素和PPARγ 两者mRNA的变化趋势具有一致性，小檗碱剂量依赖性下调脂联素mRNA表达非常显著（P

4 讨论

在检测转录水平的定量方法中都需要应用内参基因对目标基因表达量进行校正。理想的看家基因应该在各种实验因素条件下恒定表达，常用内参基因有参与细胞骨架形成的β-actin和α-tubulin，参与细胞能量代谢的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），参与蛋白质合成的18S rRNA等。为了确保精细定量结果的可靠性，本实验室采用最新的绝对定量ddPCR法检测α-tubulin，β-actin和GAPDH内参基因进行相互校正，结果发现各组脂肪细胞β-actin和α-tubulin的绝对数值和相对比值都很接近，而GAPDH的绝对数值比较离散，相对比值各组间变化较大，IR组GAPDH表达升高，其他组以IR组GAPDH进行标准化处理得到数值比实际数值偏高，目的基因表达结果容易被误读，不适合在IR脂肪细胞研究中作为内参基因使用。究其原因是GAPDH是参与糖酵解和糖异生过程中的关键酶，在胰岛素和地塞米松联合建立的IR脂肪细胞与正常脂肪细胞表达差异较大。α-tubulin基因稳定表达但表达量较低，所以β-actin比α-tubulin更合适作为IR脂肪细胞定量表达研究中的内参基因。绝对定量的ddPCR方法可以更简单直观选择合适内参基因，具有明显技术优势[7]。

研究发现小檗碱剂量依赖降低IR脂肪细胞脂联素基因表达，与ddPCR和qPCR 2种定量方法呈现高度的一致性，说明实验结果是可信的。但在PPARγ基因剂量依赖研究上，ddPCR和qPCR结果有些差异，究其原因可能是2种方法精确度的差异。对于qPCR而言，不同组间Ct差异很大，随着Ct增大，扩增效率逐步降低，最终影响相对定量结果的准确性[8]。ddPCR是基于通过油水两相间隔得到以液滴为单位的PCR反应体系液进行绝对定量，不依赖于扩增曲线的循环阈值进行定量，不受扩增效率的影响，因而ddPCR比qPCR有更高的精确度[9]，基于两者原理上不同更应采信ddPCR结果。除ddPCR探针检测外，本实验采用qPCR探针法检测抵抗素和瘦素mRNA表达，结果发现对于20，50，100 μmol・L-1小檗碱组而言，抵抗素基因Ct已达到或超出31循环，超出荧光定量法检测可信区间。模型组瘦素基因Ct已达到34循环，无法可信检测。探针定量方法对比研究发现ddPCR比qPCR有更宽的线性范围和更高的精确度，尤其在对极低表达基因检测上具有无可比拟的技术优势[10]。

PPARγ是脂肪细胞中唯一高丰度表达的核受体，与脂肪细胞分化、糖脂代谢及炎症的反应关系密切，PPARγ激活后可结合在脂联素基因的启动子位置正调控其转录，脂联素可以通过磷酸化激活骨骼肌和肝脏的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），刺激糖利用和脂肪酸氧化来增加胰岛素敏感性[12]。拮抗剂GW9662实验证实PPARγ对脂联素基因直接正调控作用。结果揭示小檗碱改善脂肪IR并非通过PPARγ依赖途径在转录调控水平上调脂联素mRNA表达来增强胰岛素敏感性，推测可能是小檗碱在翻译后调控水平激活AMPK来升高具有活性脂联素高聚体比例来实现[12]，小檗碱这种非PPARγ依赖途径的胰岛素增敏机制有待深入研究。

在脂肪细胞因子中抵抗素和瘦素发现较晚，功能机制研究相对不如脂联素确切。有些研究表明瘦素和抵抗素可增加IR作用，两者均可导致胰岛素抑制脂解作用减弱，使内脏脂肪更易脂解，释出游离脂肪酸，胆固醇，甘油三酯等浓度升高从而加重IR；研究发现瘦素可抑制胰岛素表达和分泌，抵抗素可使胰岛素作用受损[13]。周立斌等研究结果发现10 μmol・L-1小檗碱降低前脂肪细胞抵抗素和瘦素基因表达[14]。以往这两者mRNA表达研究较少涉及IR脂肪细胞，究其原因可能是基因检测手段受限。借助ddPCR定量新技术，本研究表明小檗碱剂量依赖下降IR脂肪细胞的抵抗素和瘦素mRNA表达减轻IR。通过对小檗碱对PPARγ和脂肪分泌因子表达的研究有助于研究者深入了解其改善脂肪IR的作用机制。

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