西门塔尔牛GH基因和经济性状关系探索
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随着世界经济的发展,人类食品结构发生了很大变化,牛肉已成为当今世界消费量第二大的肉类产品。各国市场对牛肉的需求,一方面是为了满足以快餐为主的大众化牛肉,另一方面是满足西式牛排及铁板烤牛肉(雪花牛肉)等高档次消费。因此,充分利用科研成果,借助现代生物技术手段对中国西门塔尔牛进行有效的遗传改良,可以更快速的发展中国肉牛生产,改善牛肉品质。生长激素(growthhormone,gh)又称促生长素,是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一类单链多肽类激素,它可与肝脏的生长激素受体(growthhormonereceptor,GHR)结合来发挥生物学作用(曹红鹤等,1999;郝金平等,1999)。牛生长激素(bGH)基因包含5个外显子,4个内含子,全长2856bp(Fries等,1993)。目前对bGH的研究多集中在多态位点与产奶性状、生长发育性状的相关性分析上。Hoj等(1993)利用PCR-RFLP技术发现BGH3′端有插入或缺失突变,且与乳脂量有关。Lucy等(1993)曾报道荷斯坦牛的GH基因2141位点AA型有较高产奶量的育种价推定值(estimatedtrans-mittingability,ETA)。Falaki等(1997)研究结果发现,荷斯坦牛GH基因TaqⅠ酶切位点的E等位基因与低产奶量、低乳脂率、低乳蛋白相关。在肉牛上,Sneyers等(1994)研究结果发现,GH基因的TaqⅠ酶切位点与肉牛的经济性状存在相关性。本试验旨在检测GH-P3位点在中国西门塔尔牛群体中的多态性,并运用最小二乘拟合线性模型分析该位点与其重要经济性状的相关性进行分析,以期为中国西门塔尔牛的分子标记辅助选择提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验动物
选取6月龄左右公牛135头,集中育肥12个月,同时屠宰,牛颈静脉采血,ACD摇匀抗凝(ACD∶血液=1∶6),-20℃冻存备用。
1.2试验方法
1.2.1提取基因组DNA
利用苯酚—氯仿抽提方法提取基因组DNA,用100~200μLTE,4℃溶解DNA,-80℃保存。
1.2.2引物设计及PCR扩增
根据GenBank上公布的序列(登录号:NM_180996)用Primer5.0软件设计引物,引物序列为:F:5′-TGTGGGTCCCT-TCCATGCT-3′,R:5′-CCTCAGGTACGTCTC-CGTCTTAT-3′,预期扩增片段大小为417bp。引物由北京赛百盛技术有限公司合成。PCR反应体系为20μL:模板DNA100ng,15mmol/L10×Buffer(含Mg2+)2.0μL,10mmol/LdNTP0.4μL,10μmol/L上、下游引物各0.5μL,TaqDNA聚合酶0.3μL,ddH2O15.3μL。PCR反应条件为:95℃预变性5min;94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸30s,38个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
1.2.3PCR-RFLP分析
酶切反应体系为10μL:PCR产物5μL,限制性内切酶AluⅠ0.4μL,10×Buffer1μL,ddH2O3.6μL,混匀,37℃消化过夜,用3%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4模型分析
在数据处理中,考虑牛来源、育肥棚舍和基因型的效应,建立了如下固定效应统计模型:yijkl=μ+Ci+Sj+Gk+eijkl式中,yijkl表示个体表型记录;μ表示总体平均;Ci表示牧场效应,即育肥前来源于不同的牧场,i=1,2…8;Sj表示饲养环境效应,即育肥时在同一育肥场的不同舍,j=1,2,3;Gk表示标记基因型效应,k=1,2,3;eijkl表示随机效应。分析结果用最小二乘均数±标准误表示(LSM±SE)。
2结果与分析
2.1酶切分型结果
GH-P3位于GH基因第5外显子(登录号:NM_180996)的第519位,C/G颠换,导致亮氨酸/缬氨酸替换。以GH-P3-F和GH-P3-R为引物进行扩增,扩增产物长度为417bp,与预期片段大小一致。用AluⅠ酶切,3%琼脂糖凝胶电泳检测,结果出现3种基因型:AA型(214、152和51bp)、AB型(214、203、152和51bp)、BB型(214和203bp)(图1)。
2.2GH-P3位点基因型频率和基因频率
对GH-P3位点的基因型频率和基因频率进行分析,结果见表1。由表1可知,GH-P3位点检测到AA、AB、BB3种基因型,基因型频率为0.40、0.46、0.14,AB基因型为优势基因型;A等位基因的频率为0.63,B等位基因的频率为0.37,A等位基因为优势等位基因。
2.3多态信息含量、杂合度、有效等位基因数及卡方检验分析
对西门塔尔牛GH-P3位点的多态信息含量、杂合度、有效等位基因数进行计算,结果见表2。由表2可知,西门塔尔牛GH-P3位点的多态信息含量为0.36,处于中度多态;杂合度和有效等位基因数分别为0.46、1.86。经χ2适合性检验,GH-P3位点在该群体已处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。
2.4GH-P3位点与西门塔尔牛经济性状的关联分析
GH-P3位点与中国西门塔尔牛经济性状进行关联分析,结果见表3。由表3可知,GH-P3位点与胴体重、屠宰率、净肉重、净肉率和背膘厚5个性状有一定的相关性。BB基因型个体胴体重比AA、AB基因型分别高38.94、35.66kg,差异极显著(P<0.01);BB基因型个体净肉重比AA、AB基因型分别高38.90、35.50kg,差异极显著(P<0.01);BB基因型屠宰率和净肉率显著高于AA、AB基因型(P<0.05),AA、AB基因型间差异不显著(P>0.05);AA基因型背膘厚极显著低于AB、BB基因型(P<0.01),AB、BB基因型间差异不显著(P>0.05)。
3讨论
高雪等(2006)利用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法研究了牛GH基因的遗传多态性及各多态位点对肉牛生长发育性状的影响。研究结果表明,GH-P3即第5外显子2141bp处和3′非翻译区的GH-P4位点对牛的体重、体高、体斜长、胸围和肉用指数(BPI指数)的影响达到显著或极显著水平,并且提出ABBB是影响牛生长发育性状的最佳基因型组合。本研究在牛GH基因第5外显子2141bp处找到一个CG突变,导致亮氨酸变为缬氨酸,这与Zhang等(1994)、Lucy等(1993)及高雪等(2006)的研究结果相一致,白晶晶(2009)在牦牛GH基因上并未发现这一突变。Yaoi等(1996)还在2258bp处检测到了AC的突变,这表明在牛品种中GH的第5外显子是一个高突变区域。2004年该位点在西门塔尔牛群体中尚未达到Hardy-Weinberg平衡(高雪等,2006),但在本研究群体中已达到Har-dy-weinberg平衡。Lucy等(1993)研究结果发现,该位点在Holstein、Guernsey和Jersey等奶牛群中CC型产奶量更高;高雪等(2006)发现该位点在鲁西牛、南阳牛和西门塔尔牛中杂合型个体的体重、体高、肉用指数显著高于两种纯合型个体。本研究采用最小二乘拟合线性模型进行关联分析,结果发现,该位点对胴体重、屠宰率、净肉重、净肉率及背膘厚有显著影响(P<0.05),并且BB基因型个体在所观测的宰前活重、平均日增重等10个经济性状上,比AA、AB基因型都具有相对较大的观测值,其中在胴体重、屠宰率、净肉重、净肉率及背膘厚等5个经济性状上的观测值显著或极显著高于AA与AB基因型,表明B等位基因为西门塔尔牛群的有利等位基因。这一结果与Schlee(1992)发现杂合子胴体重及肉质显著高于纯合子的结论不太一致。本试验中BB基因型个体屠宰率和净肉率等产肉率指标均高出其它基因型个体5%以上,背膘厚也比AA基因型个体高0.09cm,虽然嫩度不及AA型个体,但差异并不显著。因此根据本研究结果,GH-P3位点适用于中国西门塔尔牛群体的分子标记辅助选择,且BB基因型个体是主要的选择目标,利于产生更大的经济价值。