二次外周血干细胞移植改善兔肢体缺血的实验研究

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[摘要] 目的 建立兔肢体缺血模型，观察二次外周血干细胞移植对肢体缺血的治疗效果。 方法 连续4 d皮下注射7.5 μg/kg G-CSF进行干细胞动员，分离外周血单个核细胞制成干细胞悬液。制备兔肢体缺血模型，将干细胞悬液分10～12个点注射于手术切口两侧肌肉，实验组动物于移植后第18天重复进行干细胞动员并在第22天进行第二次干细胞移植。 结果 术后多普勒超声显示手术肢体的血液供应阻断，模型制备成功。1周后检测侧支循环开始建立，实验6周后，二次移植兔缺血部位肌肉毛细血管密度平均为26.1个，单次移植兔为20.9个，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 二次外周血干细胞移植能更好地改善肢体缺血。

[关键词] 缺血模型；外周血干细胞；二次移植

[中图分类号] R332[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）04（b）-0035-03

骨髓干细胞移植治疗肢体缺血安全、有效[1]。但由于采髓量大，对患者的全身情况要求高，若进行第二次采髓增加干细胞移植次数相对困难。随着干细胞研究技术的深入发展以及自体外周血干细胞移植治疗肢体缺血技术的出现，采集第二次外周血干细胞对肢体缺血的治疗成为可能。本研究通过手术切除兔下肢动脉血管建立肢体缺血模型，并以自体外周血干细胞移植一次为对照，旨在通过增加外周血干细胞移植次数研究对肢体缺血的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰白兔27只，体重2.6～3.4 kg，平均3.1 kg，雌雄不限，由徐州医学院动物实验中心提供。设实验组（二次移植）14只，对照组（一次移植）13只。

1.2 主要材料

粒细胞集落刺激因子（G-CSF，厦门特宝公司），兔淋巴细胞分离液（密度1.096 5 g/mL，天津灏阳公司）。

1.3 第一次干细胞动员

所有动物术前连续4 d以7.5 μg/kg经皮下注射G-CSF进行干细胞动员。注射前及注射过程中经耳缘静脉采血计数白细胞。

1.4 模型制作方法[2]

术前12 h禁食禁水，手术时以10 g/dL水合氯醛1.8 mL/kg沿耳缘静脉缓慢推入，待角膜反射迟钝后仰卧固定，右下肢常规备皮消毒，铺无菌洞襟，沿股动脉走向切开皮肤，暴露股三角区，从腹股沟韧带至膝关节，钝性分离血管鞘，将所有动脉分支包括股深动脉、旋股外侧动脉、动脉、动脉及股浅动脉等结扎并离断剔除股动脉，分层缝合肌肉及皮肤。手术过程严格无菌操作，术后连续3 d健肢肌注青霉素20万U/（kg・d），预防伤口感染。

1.5 干细胞移植

肝素润湿20 mL注射器及头皮针，手术麻醉前经耳静脉采集20 mL外周血，肝素抗凝。与模型制备同时进行单个核细胞的分离，生理盐水1∶1稀释，置于兔淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min，分离单个核细胞，生理盐水洗涤3次。调整细胞密度1×107/mL，肌肉层缝合后沿手术切口走向两侧内收肌群及腓肠肌用1 mL皮试针分10～12点注射。

1.6 第二次干细胞动员与干细胞移植

实验组动物于术后第18天开始重复“1.3”项下实验步骤进行第二次干细胞动员，动员结束后第二天重复“1.5”项下实验步骤进行第二次外周血干细胞移植。

1.7 观测指标

1.7.1 动态观察观察动物活动情况，肢体颜色、温度变化（红外体温检测仪，DT-880B型，深圳华盛昌公司）及肌肉萎缩情况。

1.7.2 皮肤微循环灌注测定10 MHz多普勒超声仪分别于术后l d、1周及6周于缺血股内侧正中部位行彩色多普勒血流灌注显像和频谱多普勒检测。

1.7.3 免疫组化检测毛细血管密度第一次干细胞移植术6周（实验组动物第二次移植术后3周）后，经耳缘静脉注射20 mL空气处死大白兔，取股骨中段和胫骨背侧的肌肉3～5块，10%甲醛溶液固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋，做成10 μm厚的切片，免疫组化染色，在光学显微镜下，每张切片随机计数5个高倍视野内的棕黄色染色管状数，取其平均数，计数新生毛细血管数。

1.8 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床评价

造模后动物拒动，进食、进水少，术侧肢体蜷缩，活动时出现跛行，皮肤显苍白，末端发绀明显。造模侧肢体皮肤温度（26.1±2.3）℃，明显较健侧温度（31.6±1.3）℃低，移植后1周，造模肢体温度略有回升，达（28.8±1.9）℃。实验组二次移植后3周与对照组比较，两组动物皮温差异无统计学意义。移植后6周造模侧肢体功能虽然基本恢复正常，但均有不同程度的肌肉萎缩。动物处死后，沿原手术切口切开，与健侧比较，术侧肢体筋膜少，肌肉萎缩明显。整个实验过程中无表皮坏死、足趾脱落现象。

2.2 影像学检查

术后1 d彩色多普勒血流灌注显像及血流频谱图显示造模侧肢体与健侧比较，腹股沟以下至膝关节处股动脉段缺如、无血流信号，表明术侧肢体的血液供应完全被阻断，模型制备成功。1周后复查，相应股内侧部可见稀疏的短棒状血流信号，有少量血管侧支循环建立，6周时显示明显的充盈减慢和细微血管建立的侧支循环，二次移植组略多于单次移植组。

2.3 毛细血管密度测定

取制备的病理切片，高倍镜下计数毛细血管密度，二次移植组毛细血管密度平均为（25.1±5.4）个，单次移植组为（20.9±4.4）个，二次移植组的肌肉标本毛细血管密度高于单次移植组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

缺血性下肢血管病是临床常见疾病，其发病率随年龄的增长而明显增加，45～54岁发生率为0.6%，55～64岁的发生率为2.5%，65～74岁的发生率为8.8%。我国中老年人肢体缺血性疾病的发病率为（5～10）/10 000。对于肢体慢性缺血性疾病，药物治疗可扩张血管，部分改善肢体缺血部位的侧支循环，无法从根本上解决缺血问题[3]。患者多年老体衰，经常伴有慢性心脑血管疾病，耐受力差，往往不能承受外科手术旁路移植或血管介入治疗[4]。随着对干细胞特性的研究深入，干细胞移植技术为肢体慢性缺血的治疗带来了新思路。

干细胞具有自我更新特性和多项分化潜能，在一定条件下可以分化为血管内皮细胞和释放一些血管新生因子促进血管新生。2002年，日本关西医科大学在国际上首次报道了应用自体骨髓干细胞治疗下肢血管病[5]。2003年初，首都医科大学宣武医院在国内率先开展自体骨髓干细胞移植治疗严重下肢缺血取得成功以来，目前已治疗了数百例患者，取得了满意的疗效。但由于多患者年老体弱，多伴有其他心脑血管疾病，无法承受400～500 mL的骨髓血采集量，其临床应用受到了一定的限制[4]。于是人们开始寻求创伤更小的干细胞移植方法。

造血干细胞主要储存在骨髓，仅有少量存在于外周血循环，因此外周血干细胞的研究未引起足够的重视。骨髓干细胞动员技术的采用使得外周血干细胞移植成为可能。2002年中国医科院天津血研所[6]开展了动员的自体外周血干细胞移植治疗下肢动脉闭塞症的临床研究，移植3个月后进行疗效评估，患者的症状体征得到了显著改善，溃疡愈合，皮温上升，血流增加且无不良反应。表明自体外周血干细胞移植治疗缺血性下肢血管病，简单、安全、有效。其可能的机制为动员到外周血的干细胞移植到局部后可提供内皮祖细胞和（或）在局部释放多种血管生成因子，共同促进血管新生[3，7]。谷涌泉等[8]在对自体骨髓干细胞和外周血干细胞移植治疗下肢缺血的对比研究后也认为两种不同来源干细胞治疗下肢缺血在血管新生方面差异无统计学意义（P > 0.05）。

干细胞移植技术治疗糖尿病足、下肢动脉硬化性闭塞症等下肢严重缺血性疾病，可增加下肢血供，升高皮温，缓解疼痛，溃疡愈合，改善间歇性跛行，使部分患者避免截肢或降低截肢平面。但单次移植往往不能满足患者需求，因此有患者愿意行第二次移植[9]。而采集动员后的外周血干细胞总量明显多于骨髓干细胞，因此外周血干细胞成为二次移植的首选干细胞来源。本研究表明兔缺血肢体二次移植组的新生毛细血管数明显高于单次移植组，因此进行干细胞二次移植是有必要的。但如何设定移植间隔时间以及是否需要更多次的移植还有待于进一步研究。

外周血干细胞移植已成为治疗肢体缺血的有效手段。干细胞动员可促进骨髓粒系祖细胞增殖分化，释放大量粒细胞到外周血中，使白细胞计数骤增，可使得原本具有高凝素质患者的血粘度在短期内进一步增高，会诱发心脑血管危险[7]。尤其是在外周血白细胞计数升至40×109/L以上时。由于下肢缺血性疾病患者多为中老年人，多患有慢性基础性疾病，罹患心脑血管疾病者多，易在干细胞动员过程中发生意外。因此进行干细胞动员时必须加强预防，控制原发病，预防性肝素治疗，动态监测血常规，把握采集时机，减少并发症的发生，确保临床治疗安全。

[参考文献]

[1]谷涌泉，张建，郭连瑞.自体骨髓干细胞移植治疗下肢严重缺血[J].中国临床康复，2004，8（35）：7970-7972.

[2]韩光宇，任思坡，谭昆，等.自体外周血干细胞移植治疗家兔肢体缺血[J].现代检验医学杂志，2011，26（2）：109-111.

[3]张丽，韩毅，徐世莲，等.干细胞移植治疗兔下肢肢体缺血的实验研究[J]，昆明医学院学报，2010，3（5）：35-38.

[4]张建，谷涌泉.自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血[J].中华医学杂志，2007，87（26）：1810-1811.

[5]Tateishi E，Matsubara H，Murohara T，et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cell：a pilot study and a randomized controled trial [J]. Lancet，2002，360：427-435．

[6]黄平平，李尚珠，韩明哲，等．自体外周血干细胞移植治疗下肢动脉硬化性闭塞症[J].中华血液学杂志，2003，24（6）：308-311.

[7]闻进朝，黄平平.自体外周血单个核细胞移植治疗严重肢体缺血30例[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（45）：8526-8530.

[8]谷涌泉，张建，齐立行，等.自体骨髓干细胞和外周血干细胞移植治疗下肢缺血的对比研究[J].中国修复重建外科杂志，2007，21（7）：675-678.

[9]张鸿坤，李鸣，封华，等.骨髓动员外周血干细胞移植治疗严重肢体缺血的临床应用[J].浙江大学学报：医学版，2007，36（4）：360-363.