氟化钠对长期细胞的意义
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作者：王宁王俐张慧君孙静秋郑卫东肖萍单位：上海市疾病预防控制中心毒理研究室
氟在地壳中的含量（以质量计）位于第13位，普遍分布于自然界。自1945年发现氟有防龋功效以来，氟化物已被广泛用于饮水及口腔用品加氟预防龋齿，临床上还用氟化物防治骨质疏松症松症，加之工业“三废”排放造成的环境污染，人群暴露于氟的机会愈来愈多。适量的氟为机体所必需，但摄入过量的氟会使机体发生氟中毒。因此，有关氟的安全性问题引起了人们的关注，尤其是其潜在的细胞毒性和遗传毒性。但由于各个实验室之间的差异和试验方法的敏感性不同，关于氟化钠（sodiumfluoricle，NaF）是否引起DNA损伤以及引起损伤剂量的结论也不一致。笔者利用体外培养技术研究在不加入体外活化系统的条件下，NaF对大鼠软骨细胞的增殖抑制作用及DNA损伤作用，以进一步揭示NaF的毒性作用机制。
1材料与方法
1.1主要试剂及仪器
恒温气浴摇床(日本Eyela公司)，CO2培养箱（美国Thermo公司），DMI3000B型倒置显微镜（德国Leica公司），PowerWaveXS型酶标分析仪（美国Bio-Tek公司），DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂），DYC34A型电泳槽（北京市六一仪器厂），BX51型荧光显微镜（日本Olympus公司）。NaF（含量>99.9%，美国Sigma公司进口分装），DMEM/F12培养液（美国Sigma公司），胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），透明质酸酶、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶均购自美国Sigma公司，噻唑蓝[溴化-3-(4，5-二甲基乙噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑，MTT]、Tris-HCl、Triton-100、正常熔点琼脂糖（NMA）、低熔点琼脂糖（LMA）均为美国Amresco公司进口分装，二甲基亚砜（DMSO）、溴化乙锭（EB）均购自美国Sigma公司，Na2-EDTA（上海化学品试剂有限公司）。
1.2软骨细胞的分离、制备
将2只2月龄SPF级雌性SD大鼠处死，在严格消毒的条件下，剪开膝关节，削取关节表面软骨，放入盛有灭菌PBS的培养皿中，清除表面血污。用PBS冲洗数次后，将软骨剪切为1mm3大小的碎块，移入无菌培养皿内。加入4ml透明质酸酶，室温孵育5min后倒去液体。再加入透明质酸酶4ml，再用PBS冲洗2次，移入离心管中。用10ml的胰酶37℃摇床消化30min，静置5min，弃上清，用PBS洗2次。再用4mlⅡ型胶原酶37℃培养30min，去除上清液。最后再用4mlⅡ型胶原酶液37℃恒温振荡180min，收集上清液，以1000×g离心5min。用PBS清洗后加入DMEM/F12培养液（含10%胎牛血清），制成细胞悬液。
1.3方法
1.3.1MTT法参照文献[4]，取对数生长期细胞以2×105个/孔接种于24孔培养板中，培养24h贴壁后，各染毒组用含NaF终浓度为0（阴性对照）、0.1、1.0、10.0、20.0、40.0mmol/L的培养基分别处理2、4、8、24h，同时设立空白对照（DMEM/F12培养液）组，每组均设3个平行孔。染毒结束后，加入MTT作用4h，再加入DMSO溶解蓝紫色结晶物，在酶标仪上选择570nm波长测定各孔吸光度（A）值，取均值，计算细胞存活率[细胞存活率=（染毒组A值-空白对照组A值）（/阴性对照A值-空白对照组A值）×100%]。
1.3.2单细胞凝胶电泳（SCGE）法取对数生长期细胞以2×105个/孔接种于24孔培养板中，培养24h贴壁后，用0（阴性对照）、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mmol/LNaF染毒4h，阳性对照组在紫外灯下照射10min。染毒结束后，制成单细胞悬液，按照Singh等的方法进行碱性单细胞凝胶电泳实验。染色后在荧光显微镜下，每组随机拍摄200个左右细胞，计算DNA损伤（拖尾）细胞率[DNA损伤（拖尾）细胞率=DNA损伤（拖尾）细胞数/细胞计数×100%]；并随机选择30个细胞，采用朱志良等研发的IMI1.0彗星分析软件测定损伤细胞数、尾长、Olive尾矩、彗星矩。
1.4统计学方法
所有数据以x±s表示。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（OneWayANOVA）。进一步进行组间两两比较时，若方差齐时，采用SNK检验（Student-Newman-Keuls法）；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。率间的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MTT法测定结果
倒置显微镜下观察，阴性对照组和低浓度（0.1～1.0mmol/L）NaF染毒组细胞分裂旺盛，呈典型棱形或三角形；随着NaF染毒浓度的增加和染毒时间的延长，细胞逐渐圆缩，折光性减弱，胞质中颗粒物增多；高剂量（40mmol/L）NaF染毒组大部分细胞脱落，漂浮于培养液中。不同浓度NaF染毒大鼠软骨细胞不同时间后A值和存活率的变化见表1。与阴性对照组比较，染毒2h后20.0、40.0mmol/LNaF染毒组和染毒4、8、24h后10.0、20.0、40.0mmol/LNaF染毒组大鼠软骨细胞的细胞活性均下降，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。且随着NaF染毒浓度的升高，大鼠软骨细胞的存活率呈下降趋势。见表1。
2.2单细胞凝胶电泳结果
荧光显微镜下，阴性对照组细胞核呈圆形，少数细胞拖尾；阳性对照组几乎100%拖尾，彗星细胞头小而亮，彗尾较长。各染毒组绝大多数细胞都出现拖尾。随着NaF染毒浓度的升高，彗星头部变小，亮度增加；彗尾变长变圆，荧光强度增加。不同浓度NaF染毒大鼠软骨细胞DNA损伤的变化见表2。表2可见，与阴性对照组相比，各浓度NaF染毒组大鼠软骨细胞DNA损伤率均较高，差异有统计学意义（P<0.01）。且随着NaF染毒浓度的升高，大鼠软骨细胞DNA损伤率呈升高趋势；但各浓度NaF染毒组细胞损伤率间比较，差异无统计学意义。不同浓度NaF染毒大鼠软骨细胞尾长、Olive尾矩和彗星矩的变化见表3。表3可见，与阴性对照组相比，1.0～10.0mmol/LNaF染毒组大鼠软骨细胞尾长、Olive尾矩和彗星矩较高，差异有统计学意义（P<0.01）。且随着NaF染毒浓度的升高，大鼠软骨细胞尾长、Olive尾矩和彗星矩均呈上升趋势。
3讨论
MTT实验通过检测线粒体中的琥珀酸脱氢酶可间接地反映活细胞数量。本实验结果显示，当NaF浓度较低（0.1～1.0mmol/L）时，细胞存活率没有时间变化趋势，与阴性对照组相比，细胞活性间差异无统计学意义。随着染毒浓度的升高和染毒时间的延长，细胞存活率逐渐下降，说明NaF致大鼠软骨细胞急性毒作用存在阈值。但是在NaF浓度较高时，细胞存活率下降减缓，且随着作用时间的延长，这种趋势更加明显。表明NaF在本实验浓度范围内对大鼠软骨细胞的毒性作用符合一般毒性效应规律。单细胞凝胶电泳又称彗星试验（cometassay），是近10年来发展十分迅速的检验细胞DNA损伤的新技术，笔者采用此技术检测NaF对软骨细胞DNA损伤的情况。MTT实验结果显示，10mmol/LNaF作用4h时，大鼠软骨细胞存活率约为70%，而DNA已严重损伤。本实验结果显示，与阴性对照组比较，低浓度（0.1～1.0mmol/L）NaF染毒的大鼠软骨细胞的细胞存活率约为93.33%~95.83%，差异均无统计学意义；而DNA损伤率已较高，约为81.41%～91.12%，差异均有统计学意义（P<0.01）；且大部分细胞开始出现拖尾，除1.0mmol/LNaF染毒组（P<0.01）外，0.1、0.5mmol/LNaF染毒组大鼠软骨细胞的尾长、Olive尾矩和彗星矩虽较高，但差异无统计学意义。
本实验结果还显示，随着NaF染毒浓度的增加（1.0～10.0mmol/L），细胞DNA损伤率继续升高，与阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.01）；但是尾长、Olive尾矩和彗星矩开始迅速增大，差异均有统计学意义（P<0.01）。这表明，此时细胞拖尾更加明显，DNA损伤也更加严重。关于氟化物的遗传毒性说法不一，多数学者认为氟可导致细胞核酸发生改变。体内研究表明，氟骨症患者外周血淋巴细胞微核率及姐妹染色单体交换率（SCE）均高于对照人群，说明高氟可干扰DNA的稳定性，并影响细胞免疫。体外研究也揭示，NaF可引起培养的人成纤维细胞的DNA损伤和大鼠大脑神经细胞株（JHU-1）细胞的DNA单链的断裂。但1988年，Tong等的研究表明，氟化物无遗传毒性，仅影响细胞功能和酶活力。因此，笔者认为氟对遗传基因的毒性作用尽管弱于一般的遗传毒物，但高剂量、长时间作用可致细胞DNA发生损伤。氟致DNA损伤的作用机制有以下几种推测：（1）干扰酶的活力和其他微量元素的代谢，引起DNA损伤。（2）氟化物作为外源性诱导物，引起复制DNA的断裂，造成遗传信息错误。（3）氟与尿嘧啶及酰胺有很强的亲和力，含-NH-F基团的化合物可引起A-T碱基氢键断裂，造成DNA、RNA结构改变，干扰它们的合成，增加DNA复制过程中碱基配对的错误频率。不同浓度的NaF致DNA损伤的确切机制，有待进一步研究。