马铃薯病毒RT—PCR检测体系的建立

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摘要 依据马铃薯病毒PVS、PVX、PLRV、PVA的CP保守序列设计特异性引物，从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA，进行cDNA 合成和PCR扩增，得到了与预期片段长度一致的PCR 特异扩增产物，建立了能够同步检测PVS、PVX、PLRV、PVA的rt-pcr 多重检测体系。该方法对PVS、PVX、PLRV、PVA扩增出的靶带大小分别为435、625、222、300 bp，凝胶电泳易辨别区分。研究结果表明，该方法特异性好、灵敏度高、快速简便，为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。

关键词 马铃薯病毒；RT-PCR；检测体系；建立

中图分类号 S435.32；S41-30 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）21-0015-03

Establishment of Potato Virus Detection by RT-PCR

CHEN Yang-ting SANG You-shun

（Chengdu Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Chengdu Sichuan 611130）

Abstract Based on the nucleotide sequence of the coat protein（CP）gene of the four main potato virus（PVS、PVX、PLRV、PVA）to design DNA primers.The total RNA was directly extracted from virus infected potato leaves.By the reverse transcription and polymerase chain reaction（RT-PCR），and a specific fragment with expected length was obtained.The optimized multiplex reverse transcription polymerase chain reaction（m-RT-PCR）can amplify PVS，PVX，PLRV and PVA simultaneously，and the fragments were 435 bp（PVS），625 bp（PVX），222 bp（PLRV），300 bp（PVA）.The results showed that it was a specific，sensitive detecting method and quicker，simpler.It provided an effective method of the detection for potato virus.

Key words potato viruses；RT-PCR；detection system；establishment

马铃薯是世界上第四大粮食作物，具有广适性好、薯块产量高、淀粉含量丰富、种植经济效益较高等特点。随着农业产业结构的调整和国内外马铃薯加工业的不断发展扩大，市场对马铃薯的需求也逐渐增多[1]。马铃薯也是许多病虫害的广普寄主，许多病虫害均可引起马铃薯品质和产量的降低甚至绝收以及种薯的退化[2]。马铃薯是无性繁殖作物，马铃薯病毒病是马铃薯退化的主要原因，如果连年种植无毒的种薯，借助蚜虫在田间传播病毒，也会感染马铃薯病毒病；连续种植带毒的马铃薯，由于马铃薯病毒的累积效应，该病会使马铃薯严重退化，最终造成了马铃薯产量迅速下降[3]。为了使马铃薯产业安全高效，持续健康地发展，应当繁育和推广优质脱毒种薯。因此，保证马铃薯病毒检测技术体系的灵敏、快速、准确，可以有利于确保脱毒种薯生产质量。

分子生物学检测法是目前发展最快、最有发展前景的病毒检测技术。该方法特异性强、灵敏度高，从核酸水平检测病毒，可以进行大批量的样本检测，且克服血清学及其他检测方法中的一些缺点。目前，我国常采用单重RT-PCR检测病毒，如需检测复合感染样品，操作步骤繁琐，因为其局限是在1个反应管中只能检测1 种病毒，已不能满足现代生产的需求。复合感染样品检测需要进行数次RT-PCR 反应，耗时长、成本高、易造成交叉污染。

针对侵染马铃薯的主要病原病毒PVS、PVX、PLRV和PVA，本研究建立了高效RT-PCR检测体系，应用于检测四川省发生的马铃薯病毒病。该体系可以在同一反应管中同步检测4 种病毒，提高了检测的准确性和检测效率，为培育和筛选马铃薯无病毒原种材料、种薯调运的检疫检验、实施病毒病害有效的防治措施提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为来四川省主要马铃薯生产区的试管苗、种薯、田间及网室植株共134个样品，从成都市各区、市、县和彭山、洪雅、雅安、简阳等共24个采样点，大田随机采集明显有花叶、皱缩、矮化等症状的马铃薯植株，通过DAS-ELISA检测后，筛选出单独或复合感染PVX、PVS、PVA和PLRV的植株叶片作为供试材料。

1.2 试剂

植物总RNA 提取试剂盒（RNA-plant）（购自北京天根生化科技有限公司），RNA 酶抑制剂（RNase inhibitor）、TaqDNA 聚合酶、反转录酶（TIANScript M-MLV）（购自美国MBI公司）。普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（gel MidiPu-rification Kit）、质粒小提试剂盒（prep MiniPlasmid Kit）、氨苄青霉素、X-gal、IPTG、限制性内切酶EcoRⅠ（购自日本TOYOBA公司）。

1.3 引物筛选与合成

通过查询GenBank中马铃薯病毒病4种病毒（PVS、PVX、PLRV 和PVA）分离物的CP 基因保守序列设计引物（表1），由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.4 总RNA提取

采用RNA提取试剂盒提取总RNA：称取马铃薯叶片100 mg，加液氮研磨后，置入预冷的1.5 mL离心管中，加入2-巯基乙醇，再加入RL裂解液500 μL，振荡5 min后转移至过滤柱CS上，12 000 r/min离心5 min，取上清液至RNase-free离心管中，缓慢加入无水乙醇（体积为上清0.5倍），混匀后再转入吸附柱CR中，12 000 r/min离心1 min，弃废液。向吸附柱CR中加入去蛋白液RW1，用量为700 μL，以12 000 r/min离心1 min，弃废液后，加入去漂洗液RW 500 μL，以12 000 r/min离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中重复漂洗1次。将吸附柱在12 000 r/min离心2 min，在室温下放置片刻后，放入1个新的RNase-free离心管中，向膜中央加入RNase-free水80 μL，室温放置2 min，以12 000 r/min离心2 min，得到RNA溶液，保存于-20 ℃备用。

1.5 cDNA的合成

20 μL反转录体系：20 pmoL/L病毒下游引物各0.5 μL，病毒总RNA2.5 μL，5×MMLV buffer（MBI）4 μL，10 mmoL/L dNTPs 1 μL，200 U/μL MMLV反转录酶（MMLVRT，MBI）0.3 μL，20 U/μL RNA抑制剂（Rnasin，MBI）0.2 μL，DEPC处理水补足20 μL。反转录条件：42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，4 ℃保存。在进行双重和多重RT-PCR的反转录反应时，RNA抑制剂的用量增加到0.5 μL，反转录酶的用量分别提高到0.5、1.0 μL，dNTPs 的用量增加到2 μL。在PCR扩增仪中进行扩增反应eppendorf。

1.6 PCR扩增

RCR体系（25 μL体系）：以cDNA 4 μL作为反应模板，加入10 mmoL/L dNTP 0.5 μL，10×PCR buffer（BioBRK）2.5 μL， 25 mmoL/L MgCl2 1.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶（BioBRK）0.3 μL，分别加入20 pmoL/L病毒上游引物和下游引物0.5 μL，加水补足25 μL。在进行双重和多重PCR扩增时，MgCl2的用量分别提高到2.0 μL和2.5 μL，病毒上游引物和下游引物各1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后在72 ℃下延伸10 min；反应结束后，取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 RT-PCR产物的克隆和测序

RT-PCR产物的克隆和测序由上海英俊生物技术有限公司进行。切胶回收RT-PCR产物后，PGM-T克隆按标准方法进行，阳性菌落筛选采用PCR法，提取质粒DNA，酶切验证后分别测序。

2 结果与分析

2.1 病毒总RNA提取质量

病毒总RNA的提取质量决定了病毒RNA的反转录和PCR扩增。图1为病毒总RNA提取电泳图片，从图1可以看出，电泳图片中5、18、28 s条带清晰，基本无降解发生，28 s是18 s亮度的2倍。因此，采用该试验方法对马铃薯病毒总RNA的提取效果较好，保证了后续试验的准确性。

2.2 引物对适用性检测

用筛选的4种马铃薯病毒（PVS、PVX、PLRV和PVA）引物分别进行单重RT-PCR 扩增，其分别扩增出435、625、222、300 bp 特异性单一条带，各病毒的预期值一致。分别以2、3、4 种病毒的cDNA作模板，在同一个反应体系中混合4对引物，扩增结果表明，可以同时扩增出不同病毒的特异条带，未出现杂带（图2～图5）。

因此，说明试验选取的4对引物适合进行多重检测，无交叉和相互干扰现象，特异性好。用RT-PCR方法检测马铃薯病毒，对存在的目标片断能准确检测出来，且重复性好，特异性强。

2.3 RT-PCR产物的克隆及测序

切取4种病毒的RT-PCR产物凝胶，进行扩增片段回收，克隆至PGM-T载体中，培养后，进行PCR检测，去除假阳性，得到分别含有以上几种病毒的cDNA的白色菌落，进行测序。测序结果进行BLAST分析，表明PLRV的RT-PCR扩增序列其相应病毒的序列同源性达到100%；PVA的RT-PCR扩增序列与NCBI数据库中的PVA病毒的序列同源性达到99%；PVS的RT-PCR扩增序列与NCBI数据库中的的PVS病毒的序列同源性达到98%；PVX的RT-PCR扩增序列与NCBI数据库中的PVX病毒的序列同源性达到96%。

2.4 供试马铃薯样品的病毒检测结果

利用本研究的检测技术，对样品提取总RNA 进行RT-PCR 检测。结果显示有2个样品同时检出4种病毒，16个样品检出了3种病毒，其中6个样品检出PVX、PVS、PLRV，3个样品检出了PVS、PVX、PVA，4个样品检出了PVS、PVA、PLRV，3个样品检出了PVX、PVA、PLRV，16个样品检出了PVX、PVS，13个样品检出了PVX、PLRV，2个样品检出了PVX、PVA，6个样品检出了PVS、PVA，2个样品检出了PVA、PLRV，28个样品检出了PVS、PLRV，41个样品只检出了1种病毒，即 21个样品检出PVS，7个样品检出PVX，3个检出PVA，10个检出PLRV，8个有症状样未检出病毒，有可能为其他病毒侵染。该检验结果表明，本研究建立的体系可以高效准确的检测马铃薯样品是否带毒，带的是何种病毒，该方法可靠性、稳定性良好。

3 结论与讨论

本研究以Genbank查询的马铃薯4种病毒（PVS、PVX、PLRV和PVA）的CP 基因高度保守序列设计的4 对引物，扩增靶带大小适中，GC百分含量、Tm 值相近，相互之间及与其他病毒之间均无同源性，凝胶电泳图像目标条带清晰，无杂带和引物二聚体产生，从而保证了引物的特异性。PCR 技术用于植物病毒的检测有特异性强、灵敏度高、快速简便及所需样品量少等特点，据报道PCR的灵敏度可达30 pg，比ELLSA 方法高很多[4]，是检测植物病毒的一个重要手段。与单一PCR相比，多重RT-PCR能同时扩增多个目的片段，其是在一个反应体系中加入多对引物，因此多重PCR在植物病毒检测中优势突出，具有高产率、高效、试验成本较低等优点[5]。在复杂性上，与单重RT-PCR方法相比，建立一个多重RT-PCR 方法由于受到许多因素的影响，其构建复杂得多。引物设计上，其灵敏度要达到或接近单重RT-PCR的水平[6-7]，要求多重RT-PCR避免各目的片段之间的非特异性扩增和各个引物对之间的相互干扰，使各目的片段有相近的扩增效率，设计的备选引物退火温度相近，另外需不断优化对体系中各种参数。因此，保证引物的特异性是多重RT-PCR方法检测的关键。

本试验所建立的PT-PCR体系，能有效地同时检测出PVX、PVS、PVA和PLRV等4种病毒，扩增目的条带清楚，无非特异性扩增，重复性好，可极大的简化病毒检测的工作步骤，进而进一步降低检测成本，便于马铃薯病毒的检测，对指导马铃薯抗病毒育种具有重要意义。

4 参考文献

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