高效液相色谱法测定“sebamed”防晒霜中3种防晒剂的含量
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[摘要] 目的 应用高效液相色谱（HPLC）建立“sebamed”防晒霜中二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷3种防晒剂的含量测定方法。方法 采用Alltima C18色谱柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），以甲醇-10 mmol/L磷酸二氢铵水溶液（磷酸调pH 3.0）为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长330 nm。结果 二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷的线性相关系数（r）分别为0.9999、1.0000和 0.9997；精密度和稳定性良好，RSD均< 2.0%；二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷的平均加样回收率（n = 6）分别为97.1%、97.6%和96.4%，加样回收率良好。含量测定结果显示3个批号样品中二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯的含量分别为2.56%、2.75%和2.63%；奥克林立的含量分别为7.90%、7.75%和8.02%；丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷的含量分别为2.59%、2.64%和2.71%。结论 该方法准确、简单、快速，可同r测定“sebamed”防晒霜中二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷3种防晒剂的含量。
[中图分类号]R917；TQ658.2+4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0155-04
[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of diethyl hydroxy benzene ammonia formyl acid ester， octocrilene and butyl methoxy dibenzoylmethane in “sebamed” sun lotion. Methods An Alltima C18 column （150 mm×4.6 mm， 5 μm） was used for the separation with methanol and 10 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate solution （pH 3.0） as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min in the pattern of gradient elution. The detection wavelength was 330 nm. Results The method showed good linearity with correlation coefficient （r） of 0.9999 for diethyl hydroxy benzene ammonia formyl acid ester， 1.0000 for octocrilene and 0.9997 for butyl methoxy dibenzoylmethane. The precision and stability were satisfactory with the relative standard deviations （RSD） below 2.0%. The average recovery （n = 6） of the three sun-screening agents were 97.1%， 97.6% and 96.4%， respectively. The contents of diethyl hydroxy benzene ammonia formyl acid ester were 2.56%， 2.75% and 2.63% in the three batches of samples， the contents of octocrilene were 7.90%， 7.75% and 8.02% in the three batches of samples and the contents of butyl methoxy dibenzoylmethane were 2.59%， 2.64% and 2.71% in the three batches of samples， respectively. Conclusion The established method is accurate， simple and fast， and can be used for simultaneous determination of diethyl hydroxy benzene ammonia formyl acid ester， octocrilene and butyl methoxy dibenzoylmethane in “sebamed” sun lotion.
[Key words] Sun lotion； Sun-screening agent； HPLC； Determination
紫外线照射对人体健康有诸多不利的影响，中波紫外线能使皮肤变黑、慢性光老化等，长波紫外线可引起急性皮炎、皮肤灼伤、DNA损伤等[1]。为了减轻紫外线对皮肤的伤害，人们选择使用含有防晒剂的化妆品作为防护。防晒剂分为物理性和化学性防晒剂，其中化学性防晒剂对中波和长波紫外线都有较强的吸收，能够吸收大部分紫外线，起到保护皮肤的作用[2]。但是过量使用防晒剂对会对人体产生一定的危害，如易使皮肤过敏、粗糙，刺激眼部，引起光敏反应等[3]。目前，国际上对化妆品中防晒剂的添加量有严格的控制和管理。国家食品药品监督管理总局颁布的2015版《化妆品安全技术规范》对我国准用的27种防晒剂及其限量做了明确规定[4]。文献报道化妆品中防晒剂的检测方法主要有薄层色谱法[5]、气相色谱-质谱联用法[6-8]、高效液相色谱法[9-17]、超高效液相色谱法[18-19]、液相色谱-质谱联用法[20-21]等，其中高效液相色谱法使用频率最高。《化妆品安全技术规范》及文献中所采用的流动相及提取液多为四氢呋喃和高氯酸等腐蚀性强，对液相色谱仪及色谱柱有较强损害的溶剂。本实验建立HPLC法对“sebamed”防晒霜中二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯（限量10%）、奥克林立（限量10%）、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷（限量5%）3种防晒剂进行含量测定，方法前处理简捷，样品以甲醇为提取溶剂，以甲醇-水相为流动相，可做日常检测方法使用。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1260液相色谱系统，包括：G1311C四元梯度泵，G4212B DAD检测器，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱（Agilent Technologies，美国）；Mettler XP-205电子天平（Mettler Toledo，瑞士）；KQ-800KDE超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水处理系统（Millipore，美国）。
1.2 试药
二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯对照品（批号：WG0238704-140818001，美国Ark Pharm， Inc.，纯度：98.0%）；奥克林立对照品（批号：LGBXJ-PH，梯希爱上海化成工业发展有限公司，纯度：98.0%）；丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷对照品（批号：E7HOE-TF，梯希爱上海化成工业发展有限公司，纯度：98.0%）；甲醇（色谱纯，批号：155175，美国Fisher公司）；实验室用水为超纯水。“sebamed”50倍防晒霜（批号：30028003、40008 001、40008002，德国Sebapharma GmbH & Co.KG）；“BADGER”防晒霜（批号：L6063A，美国W. S. BADGER Co.， Inc.）。
2 方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Alltima C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A-甲醇，B-10 mmol/L磷酸二氢铵水溶液（磷酸调pH 3.0）；梯度洗脱程序：0～4 min，85%A；4～6 min，85%A～90%A；6～10 min，90%A；10～11 min，90%A～85%A；11～16 min，85%A。流速：1.0 mL/min；检测波长330 nm；进样体积：20 μL；柱温为室温。进样前，所用溶液均用0.22 μm孔径尼龙滤膜过滤。
2.2 混合对照品溶液的制备
分别精密称定二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯对照品25.73 mg，奥克林立对照品27.49 mg，丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷对照品12.65 mg置于100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀，即为混合储备液。精密量取混合储备液0.4、2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，获得二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯和奥克林立浓度均约为10、50、100、150、200 μg/mL，丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷浓度约为5、25、50、75、100 μg/mL的混合对照品溶液，中间浓度的混合对照品溶液作为含量测定用的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密称取“sebamed”防晒霜0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声45 min，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，即得。
2.4 阴性溶液的制备
精密称取配方相似但不含上述3种防晒剂的“BADGER”防晒霜0.1 g，按照“2.3”项操作，即得阴性溶液。
2.5 专属性验和系统适应性实验
分别对阴性溶液、混合对照品溶液和供试品溶液进样分析，考察样品中其他成分和辅料对上述3种防晒剂定量的干扰。根据图1～2显示，样品中其他成分和辅料不干扰这3种防晒剂的测定。这3种防晒剂的分离度良好，理论板数均大于5000，分离度均大于1.5。
外光谱图
2.6 线性和灵敏度
对“2.2”项不同浓度的混合对照品溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标作标准曲线。得到二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯方程为Y = 35.31X+20.51，线性相关系数（r）为0.9999，线性范围为10.09～201.72 μg/mL；奥克林立的线性方程为Y = 26.68X+9.20， r为1.0000，线性范围为10.78～215.52 μg/mL，丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷的线性方程为Y = 69.59X-45.15，r为0.9997，线性范围为4.96～99.18 μg/mL。
将对照品溶液用甲醇逐级稀释后，以信噪比（S/N）约为3.0时的浓度为最低检测限（LOD），S/N约为10.0时的浓度为最低定量限（LOQ），测得二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯的LOD和LOQ分别为0.051 μg/mL和0.103 μg/mL；奥克林立的LOD和LOQ分别为0.055 μg/mL和0.110 μg/mL；丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷的LOD和LOQ分别为0.127 μg/mL和0.253 μg/mL。
2.7 精密度实验
对中间浓度的混合对照品溶液连续进样6次，对照品溶液中二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷峰面积的RSD（n = 6）分别为0.48%、0.56%和0.39%，说明仪器精密度良好。
2.8 重复性实验
对批号40008002的防晒霜独立制备供试品溶液6份，分别进样分析，计算得到二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷含量的RSD（n = 6）分别为1.20%、1.96%和0.97%，说明方法的重复性良好。
2.9 加样回收率实验
精密称取样品（批号：40008002）6份，分别精密加入混合储备液10 mL，按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制得各加样供试品溶液，进样测定，计算加样回收率和RSD，结果见表1。
2.10 稳定性实验
对批号20160711的供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算得到24 h内二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷色谱峰峰面积RSD（n = 6）分别为0.79%、1.53%和1.12%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.11 样品含量测定
应用建立的方法对批号为30028003、40008001、40008002的“sebamed”50倍防晒霜进行含量测定，每个样品制备3份，取平均值。测定结果显示：3个批号样品中二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯的含量分别为2.56%、2.75%和2.63%；奥克林立的含量分别为7.90%、7.75%和8.02%；丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷的含量分别为2.59%、2.64%和2.71%，均符合2015版《化妆品安全技术规范》的限量要求。
3 讨论
本实验建立了同时测定“sebamed”50倍防晒霜中二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯、奥克林立和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷3种防晒剂含量的高效液相色谱法，该方法操作简单，结果准确可靠，重复性好，可用于控制“sebamed”50倍防晒霜的质量。
3.1 色谱条件的优化
二乙氨羟苯甲酰基苯甲酸己酯和丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷紫外谱图均在360 nm处有最大吸收，而奥克林立在305 nm处有最大吸收，结合预实验结果选择330 nm作为检测波长。在流动相筛选中，有机相比较了甲醇与乙腈，水相比较了不同浓度（10、20、30 mmol/L）及不同pH值（3.0、3.5、4.0）磷酸二氢铵溶液对分析效果的影响，发现甲醇-10 mmol/L磷酸二氢铵（pH 3.0）可满足实验要求。
3.2 提取条件的选择
比较了超声时间（30、45、60 min）对提取效率的影响，发现超声30 min样品提取不完全，而超声45 min和60 min提取效果几乎相同，故选择超声提取45 min。
3.3 样品保存条件的探讨
本研究为防止防晒剂光敏感性对其稳定性的影响，在溶液配制过程中采用棕色容量瓶，样品保存期间采用棕色进样瓶。
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（收稿日期：2017-01-17 本文编辑：王 丽）