咳喘宁对病毒诱发哮喘模型大鼠CD4+、CD8+T细胞内信号转导子和转录激活子6表达的影响
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摘要：目的 通过观察咳喘宁对呼吸道合胞病毒（RSV）诱发哮喘模型大鼠cd4+、cd8+t细胞内信号转导子和转录激活子6（STAT6）表达的影响，阐明咳喘宁防治RSV诱发支气管哮喘的机理。方法 分别从磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、模型组大鼠外周血中提取单个核细胞，采用免疫磁珠法分离获得CD4+、CD8+T细胞并对其行纯度鉴定与活力检测。采用免疫荧光法，使用流式细胞仪测定T细胞内STAT6蛋白的表达水平，以中药咳喘宁进行干预，动态观察细胞培养过程中，咳喘宁对CD4+、CD8+T细胞中STAT6蛋白表达的调节作用。结果 免疫磁珠法获得的CD4+、CD8+T细胞纯度与活力均支持实验的下行进展。与PBS对照组比较，模型组CD4+T细胞含量显著升高（P0.05）。模型组大鼠CD4+T与CD8+T细胞内STAT6的表达增高，咳喘宁治疗组CD4+与CD8+T细胞内STAT6的表达水平比模型组显著下降，差异有统计学意义（P0.05）。结论 咳喘宁通过下调哮喘模型大鼠CD4+、CD8+T细胞内STAT6的表达，纠正哮喘中Th2细胞的过度增殖分化，影响Th2免疫应答优势，从而减少伏痰的产生，达到防治支气管哮喘的目的。
关键词：咳喘宁；支气管哮喘；CD4+T细胞；CD8+T细胞；信号转导子和转录激活子6；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0025-04
信号转导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STATs）是一类能与靶基因调控区DNA结合的胞浆蛋白家族，在细胞因子的信号转导中起着关键性的作用。本实验通过研究自制中药咳喘宁口服液对呼吸道合胞病毒（RSV）诱发支气管哮喘（以下简称“哮喘”）模型大鼠CD4+T、CD8+T淋巴细胞内STAT6表达的影响，旨在从信号通路的角度来阐明咳喘宁防治RSV诱发哮喘的机理。
1 实验材料
1.1 动物
新西兰大白兔，雄性，体质量1.2～1.5 kg，湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号：2009-0012；幼年SD大鼠，清洁级，体质量120～180 g，雄性，鼠龄28～42 d，湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（湘）2009-0004。
1.2 病毒、药物与主要试剂
RSV（湖南师范大学试验中心）；咳喘宁口服液（湖南中医药大学第一附属医院制剂室生产，由炙麻黄、苦杏仁、石膏、大青叶、黄芪、桃仁、细茶叶、甘草组成，每瓶100 mL，含原药材药70 g），地塞米松注射液（南京第三制药厂），沙丁胺醇雾化吸入溶液（南京第三制药厂）；磷酸盐缓冲液（PBS，北京国华化学试剂厂），卵清白蛋白（OVA，Sigma公司），氢氧化铝凝胶（北京国华化学试剂厂），20%乌拉坦（北京国华化学试剂厂），4%多聚甲醛（北京国华化学试剂厂），10%FCS（RPMI-1640培养液，海克隆生物化学有限公司，SH30），GIBCO新生牛血清（天根生化科技有限公司，16010159），胰酶（武汉博士德生物工程有限公司，PYG0015），100×双抗（武汉博士德生物工程有限公司，PYG0016），CD4+、CD8+T淋巴细胞阳性分选试剂盒（天根生化科技有限公司，Dynal分装），CD4-PE、CD8-PE抗体（invitrogen公司，美国），植物血凝素（PHA，天根生化科技有限公司，Sigma分装），白细胞介素（IL）-4（武汉博士德生物工程有限公司，BA0980），0.25%TritonX-100PBS液（天根生化科技有限公司，Amersco分装），鼠抗人STAT6（武汉博士德生物工程有限公司，BA1414），DAB显色液（武汉博士德生物工程有限公司，AR1022），STAT6单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），羊抗鼠IgG-PE荧光抗体10 ?L（武汉博士德生物工程有限公司，BA1054）。
1.3 主要仪器
M2300型CO2培养箱（美国SHELLAB公司），净化工作台HC-TP12（南通嘉程仪器有限公司），XD-101光学倒置式显微镜（重庆光学仪器厂），1×70/1×50倒置相差显微镜（日本Olympus），AXSYM-S全自动化学发光免疫分析仪（美国雅培），图像分析仪心肺血管测定软件（华东理工大学研制），Dynal MPC-S磁力架（Dynal，挪威），旋转磁珠混匀器（宁波新芝生物技术股份有限公司），FACS流式细胞仪（Becton Dickson公司），自动组织包埋机（常州中威电子仪器厂），轮转式石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司），切片漂烘温控仪（安徽电子技术研究所），低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）。
2 实验方法
2.1 咳喘宁药物血清的制备
将新西兰大白兔10只灌服咳喘宁口服液25 g/kg体质量，相当于人临床等效剂量，每日2次，连续给药3 d，末次给药后2 h，兔心脏动脉采血，无菌分离血清，经56 ℃、30 min灭活备用。
2.2 分组、造模与给药
20只幼年SD大鼠按体质量随机分为为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组，模型组，每组10只。大鼠饲养于湖南中医药大学洁净动物实验室，每5只1笼，自由饮食，控制室温25 ℃左右，湿度55%左右。所有动物适应性饲养1周后开始实验。采用我科已建立的方法[1]，模型组大鼠于第1日和第8日分3处注射共1 mL含1 mg OVA和100 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原液（两下肢内侧皮下各注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL）致敏；第21、35、49日以滴度为1.0×106空斑形成单位（PFU）的RSV50 μL鼻腔滴入。对照组以PBS致敏、激发。
2.3 外周血单个核细胞的分离
造模完成当天，常规采取PBS对照组、模型组各10只大鼠外周静脉血，将肝素钠抗凝管中的血液移至离心管中，以1∶1的比例加入Hank’s液，室温下2000 r/min离心20 min。离心结束后，管内可见分4层：最上层是血浆，第2层是单核细胞，第3层是分离液，第4层是粒细胞及红细胞。毛细吸管吸出中间的膜层细胞，再次离心，洗涤2次，将细胞悬浮在含10% FCS的RPMI-1640培养基中，并调整细胞浓度为2×107/mL，加入24孔培养板，5%CO2、37 ℃条件下培养2 h，用37 ℃预热的RPMI-1640培养液轻柔洗2次，去除非黏附细胞，即获得贴壁的单个核细胞。
2.4 磁珠结合法分离CD4+、CD8+T淋巴细胞
①吸去离心管中最上层血浆，重悬血液与缓冲液1（PBS+EDTA）至初始量；②按洗涤的全血1 mL加入12 ?L CD4+、CD8+T
（5×106 CD4+、CD8+T cell Dynabeads）的比例加入；③于2～8 ℃孵育20 min，将试管置于磁力架上吸附2 min；④弃上清液，用缓冲液1的样本原始量重悬并洗3次结合珠子的细胞，并置于磁架中1 min；⑤重悬结合珠子的细胞，在初始样本中，每毫升全血中加100 ?L缓冲液2（1% FCS）；⑥放置室温下45 min并摇匀，置于磁力架上1 min；⑦移去上清液，把释放的细胞置于一新的试管，在500 ?L缓冲液2中洗2～3次珠子并收集上清液；⑧洗涤分离的细胞重悬于10 mL的缓冲液2中，并2000 r/min离心6 min以移除分离珠子；⑨将重悬细胞于缓冲液2中；⑩离心10 min，分别获得CD4+、CD8+T淋巴细胞。
2.5 CD4+、CD8+T淋巴细胞的纯度及活力检测
配置2×105个CD4+、CD8+T淋巴细胞悬液，流式细胞仪检测其细胞纯度。以0.2%台盼蓝对初步分离得到的单个核细胞及CD4+、CD8+T 淋巴细胞染色，观察其细胞活力，以总细胞中活细胞所占百分比来衡量。取9滴细胞悬液，加入1滴0.4%的台盘蓝溶液混匀，染色2～3 min。在计数板上计数被台盘蓝染成蓝色的细胞总数（即死亡细胞）和未被台盘蓝染成蓝色的细胞总数（即活细胞），并按照下列公式计算细胞活力。每份标本至少计数200个细胞，重复计数3次，取均值。
细胞活力（%）=活细胞总数÷（活细胞总数+死亡细胞总数）×100%
2.6 CD4+、CD8+T淋巴细胞的生长状况检测
取磁珠法分离获得的CD4+T、CD8+T淋巴细胞，以RPMI-1640培养液重悬，调整细胞浓度为5×106/mL，将模型组每种细胞悬液分装到3个培养皿中，每皿细胞悬液稀释到3 mL，分别标记为A组（CD4+、CD8+T淋巴细胞加PBS 10 ?L）、B组（CD4+、CD8+T淋巴细胞加地塞米松、沙丁胺醇各5 ?L）、C组（CD4+T、CD8+T淋巴细胞加咳喘宁含药血清10 ?L），各培养皿中均加入细胞刺激剂PHA和IL-4，浓度分别为50 ?g/mL和25 ng/mL，加入96孔细胞培养板，每孔200 ?L，使终浓度为5 ?g/mL，于37 ℃、5%CO2培养72 h，采用血细胞计数板法对CD4+、CD8+T淋巴细胞进行细胞计数。
2.7 流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞内STAT6表达
①将细胞用1%甲醛冰上固定15 min，洗涤后用80%酒精-20℃固定2 h；②1000 r/min离心5 min，弃固定液，用0.25% TritonX-100PBS液冰上作用5 min；③洗涤后将CD4+、CD8+T淋巴细胞分别加入1∶100稀释度的鼠抗人STAT6单克隆抗体10 ?L（第一抗体），4 ℃过夜；④再分别加1∶40稀释度的羊抗鼠IgGl-PE荧光抗体10 ?L（第二抗体），室温孵育30 min；⑤采用免疫荧光法，根据藻红蛋白（PE）荧光标记的抗体被激发出的荧光量多少，使用流式细胞仪来确定T淋巴细胞内STAT6的表达水平。每个样本测定3次，每次测定10 000个细胞，以阴性对照调整仪器，使变异系数在2%以内，测定结果为3次的平均值。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据为定量资料，用―x±s表示，所有数据均进行正态性检验。多组样本均数比较采用方差分析，方差齐者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane’T2检验。两变量的相关分析采用Bivariate过程的Pearson直线相关法。P
4 结果
4.1 细胞纯度
免疫磁珠法获得CD4+、CD8+T淋巴细胞纯度分别为93.8±2.5、91.6±3.2，结果提示此细胞纯度支持实验的下行进展。
4.2 细胞活力
磁珠分离法获得的CD4+、CD8+T淋巴细胞用0.2%台盼蓝染色后测得的细胞活力分别为（95.5±3.2）%和（93.9±4.1）%，提示磁珠分离法对CD4+、CD8+T淋巴细胞的活力无影响。
4.3 细胞生长状况
磁珠分离法获得的CD4+T、CD8+T淋巴细胞细胞培养 72 h后，细胞数显著增多，差异均有统计学意义（P
4.4 单个核细胞中CD4+、CD8+T淋巴细胞含量比较
结果表明，与对照组比较，模型组CD4+T淋巴细胞含量显著升高（P0.05）。见表2、图1。说明在哮喘气道慢性炎症中，以CD4+T淋巴细胞（Th2）数目增多、功能增强为主；CD8+T淋巴细胞数目增高不明显，这是哮喘免疫功能紊乱的特征性改变。
4.5 CD4+、CD8+T淋巴细胞内STAT6蛋白表达
A组CD4+、CD8+T内STAT6表达水平显著高于B组和C组（P0.05）。见表3。
5 讨论
免疫磁珠（immunomagnetic bead）利用磁珠上的抗体与相应抗原发生特异性结合后形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁场作用下，发生力学移动，使复合物与其他物质分离，达到分离特异性抗原的目的。方式有2种：用免疫磁珠直接从细胞混合液中分离靶细胞者为阳性分离；用免疫磁珠去除无关细胞使靶细胞得以纯化者为阴性分离。流式细胞术又称为荧光激活细胞分选法（fluorescence-activated cell sorting，FACS），是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
哮喘慢性气道炎症的发生和发展与T淋巴细胞密切相关。CD4+和CD8+T淋巴细胞作为两种重要的T淋巴细胞亚群，在免疫系统中发挥不同的作用。CD4+T淋巴细胞根据其分泌的细胞因子又可再分为Th1和Th2亚群，如分泌IL-4、IL-13为主的CD4+T淋巴细胞称为Th2细胞，分泌γ干扰素（IFN-γ）为主的CD4+T淋巴细胞为Th1细胞；同样，分泌IL-4、IL-13为主的CD8+T淋巴细胞称为Tc2细胞，而分泌γ干扰素为主的CD8+T淋巴细胞则称为Tc1细胞。Mosmuna等[2]对Th1及Th2类细胞分泌的细胞因子进行研究发现：Th1类细胞只含有IL-2、IFN-γ及淋巴细胞毒素mRNA，Th2类细胞中只含有IL-4和IL-5 mRNA，而IL-3 mRNA在两种细胞中同时存在。用ELASA检测培养细胞的上清液，得出与上述mRNA相符的结果，同时发现这两种细胞分泌的细胞因子能抑制对方细胞的增殖和分化[3-6]。哮喘急性发作期T淋巴细胞内IL-4的表达明显加强[7]，而CD8+T淋巴细胞在IL-4等Th2型细胞因子的环境下，朝Tc2细胞方向分化，分化为分泌IL-4为主的Tc2型细胞越多，哮喘病情越严重[8]。CD4+T淋巴细胞具有调节体液和细胞介导免疫功能，通过其表面的抗原受体识别由抗原提呈细胞（APC）提供的特异性抗原信号，同时在辅助分子作用下活化、增殖。CD4+T淋巴细胞主要指Th2细胞，其数目增多、功能增强是哮喘患者免疫功能失调的典型表现，活化的CD4+T淋巴细胞释放出多种炎性细胞因子（如IFN-γ、TNF-α等Th1类细胞因子），一方面直接引发迟发性超敏反应性炎症，另一方面可活化CTL（细胞毒T淋巴细胞），产生细胞毒效应。哮喘患者存在Th1/Th2功能失调，主要表现在Th2亚群功能亢进，介导了哮喘IgE依赖的速发型变态反应及以EOS浸润为主的气道炎症，出现高IgE血症和嗜酸性粒细胞增多。有研究发现哮喘患者肺中的CD4+和CD8+T淋巴细胞数量相近[9]，急性发作期哮喘患者外周血中CD4+、CD8+T淋巴细胞比例均明显高于健康对照者，CD4+与CD8+T淋巴细胞活化、细胞数量和功能均存在异常[10-12]。
有研究表明，Th2细胞因子中的IL-4和IL-13能通过结合IL-4受体激活JAK1-STAT6信号转导途径，最终刺激T淋巴细胞增殖[13]，而STAT6信号转导途径在哮喘发作时存在明显异常[14-15]，STAT6表达水平与哮喘严重程度成正相关[16]。体外实验结果表明，咳喘宁能下调哮喘模型大鼠支气管中STAT6蛋白及其mRNA的表达[17]，为进一步探索咳喘宁对CD4+、CD8+T淋巴细胞中STAT6表达的影响，本研究采用细胞培养技术，磁珠结合法首先分离出大鼠外周血单个核细胞中CD4+与CD8+T淋巴细胞，并通过台盼蓝染色检查分离出的CD4+与CD8+T淋巴细胞的活力，评估CD4+与CD8+T淋巴细胞的纯度及生长状况，结果提示免疫磁珠法分离T淋巴细胞成功可行。
本研究发现，模型组哮喘大鼠CD4+与CD8+T淋巴细胞内STAT6的表达增高，咳喘宁治疗组CD4+与CD8+T淋巴细胞内STAT6的表达水平比模型组显著下降，两者差异有统计学意义（P0.05），表明咳喘宁能影响哮喘模型大鼠CD4+与CD8+T淋巴细胞内STAT6的表达水平。本研究结果提示，哮喘急性发作时，细胞外的增殖分裂信号可能通过STAT6信号转导途径，导致CD4+与CD8+T淋巴细胞的过度增殖分化。咳喘宁通过下调哮喘模型大鼠CD4+与CD8+T淋巴细胞内STAT6的表达，纠正哮喘中Th2细胞的过度增殖分化，影响Th2免疫应答优势，从而减少伏痰的产生，达到防治病毒诱发哮喘的目的。
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（收稿日期：2013-12-13，编辑：华强）